[发明专利]利用地衣芽孢杆菌发酵生产纳米硒的方法

权利要求书

1.利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S13发酵生产纳米硒的方法，所述地衣芽孢杆菌S13的保藏编号为CGMCC No.11742，其特征在于，包括以下步骤：

S1、菌种活化；

S2、种子液的制备；

S3、纳米硒发酵：将S2的种子液接入发酵培养基中，加入亚硒酸盐溶液，使发酵体系中亚硒酸盐的终浓度在5-100mM，进行发酵培养，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒；

所述发酵培养基的配方为：葡萄糖5-25g/L或淀粉质碳源10-45g/L、酵母提取物5-25g/L、大豆蛋白胨5-25g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2；

其中，所述淀粉质碳源选自玉米粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉或其它可溶性淀粉中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖10-20g/L或淀粉质碳源40-45g/L、酵母提取物10-20g/L、大豆蛋白胨10-20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S3的发酵条件为：温度35-38℃，转速150-250rpm，通气量0.5-1.5vvm，发酵时间24-72h。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S3中按2-5％v/v的接种量将种子液接入装有所述发酵培养基的摇瓶或发酵罐中，摇瓶装液量为20-30％，发酵罐装液量不超过80％。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1具体为：用SOC培养基对地衣芽孢杆菌进行活化培养，SOC培养基的配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，葡萄糖20mM，琼脂15g/L，pH 7.0-7.2；将地衣芽孢杆菌接种于SOC培养基斜面上，37℃培养48h。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S2具体为：用SOB液体培养基进行种子培养，SOB液体培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，pH 7.0-7.2；将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成10⁸CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150-250rpm振荡培养4-8h。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)菌种活化，同权利要求5中所述；

2)种子液的制备：将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成10⁸CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养8h；

3)纳米硒发酵：将2)的种子液按2％v/v的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，装液量65％，加入亚硒酸钠溶液，使发酵体系中亚硒酸钠的终浓度在10mM，在37℃、180rpm、通气量0.5vvm条件下培养，发酵时间24h，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒；

其中，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖10g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)菌种活化，同权利要求5中所述；

2)种子液的制备：将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成10⁸CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养4h；

3)纳米硒发酵：将2)的种子液按4％v/v的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，装液量70％，加入亚硒酸钠溶液，使发酵体系中亚硒酸钠的终浓度在10mM，在37℃、200rpm、通气量1.2vvm条件下培养，发酵时间72h，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒；

其中，所述发酵培养基的配方为：玉米粉40g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨15g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。