[发明专利]基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法

权利要求书

1.基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，包括以下步骤：

S1：同步化线虫，得到都处于L1期的线虫；

S2：将步骤S1得到的L1期线虫培养至L4期，其中，将L1期线虫均匀滴在铺有细菌的NGM培养基上，培养30-38小时，观察线虫，当线虫的身体一侧出现月亮斑时，得到L4期线虫；之后，使用K-medium溶液将NGM培养基上的L4期线虫冲洗至离心管中；

S3：将步骤S2得到的L4期线虫的K-medium溶液加入到384孔板中；0h时在显微镜下扫描384孔板并用电荷耦合装置记录图像，对所述384孔板的每个孔采集5-15帧图像并且保存图像，之后向384孔板的每个孔内加入染毒溶液，分别在染毒后的多个时间段使用显微镜下扫描384孔板并用电荷耦合装置记录图像，所述384孔板的每个孔采集5-15帧图像并且保存图像；

S4：处理数据，使用MATLAB图像处理软件对所拍摄的不同时间点的图像进行数据分析，得到不同时间点的线虫的表型指征。

2.根据权利要求1所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤S1中线虫的同步化，包括以下步骤：

(1)选取腹内含两排虫卵的N2野生型线虫，使用s-basal溶液将线虫洗至离心管中，使线虫自然沉淀；

(2)待线虫沉淀后，弃掉离心管中的上清液，使用漂白溶液溶解离心管内沉淀的线虫，溶解后的线虫在15-25℃的温度下离心3分钟，弃掉离心管中的上清液，得到线虫的虫卵；

(3)使用s-basal溶液冲洗步骤(2)得到的线虫虫卵，其中，将虫卵置于离心管中，向离心管内加入3-8ml的s-basal溶液重悬虫卵，将装有虫卵溶液的离心管平放在摇床上，防止线虫虫卵沉淀，线虫虫卵在摇床上震荡10-12小时后，得到L1期线虫；

(4)将装有步骤(3)得到的L1期线虫的离心管平放在10-20℃的恒温培养箱里，显微镜下观察计算L1期线虫的密度，并且记录L1期线虫的密度。

3.根据权利要求2所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤(2)使用漂白溶液溶解离心管内沉淀的线虫时，漩涡震荡离心管7-9分钟。

4.根据权利要求2所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤(3)中摇床保持在15-25℃的恒温状态，摇床设定为80-120转每分钟。

5.根据权利要求1所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤S2中，还包括：使用K-medium溶液多次冲洗L4期线虫沉淀，在显微镜下调配L4期线虫的密度，使L4期线虫的密度在每50μL K-medium溶液中20-40只。

6.根据权利要求1所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤S3中，在384孔板中的每个孔内50μL的L4期线虫的K-medium溶液，调配每个孔中的线虫数目使每个孔内的线虫总数维持在20-40只；若孔中线虫数目多于40只，将多余的线虫粘出；若孔中线虫数目少于20只，将孔中溶液吸出并且重新滴加等量溶液；若在显微镜下显示的孔内的图像有气泡，则吸出孔内液体并且重新添加50μL溶液。

7.根据权利要求1所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤S3中，在染毒后的6h、12h、18h和/或24h分别使用显微镜下扫描384孔板并用电荷耦合装置记录图像。

8.根据权利要求1所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤S4中，数据分析选择聚类分析、PCA的分析、未配对T检验和/或SVM的分析应用的R-package分析。

9.根据权利要求1所述的基于线虫表型指征的化学物毒性高通量筛检方法，其特征在于，步骤S4中，线虫的表型指征包括线虫死活相关的指数、线虫大小相关的指数、灰度值相关的指数、卷曲度相关的指数和活动度相关的指数。