[发明专利]检测口蹄疫A型武汉株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种特异性定量检测口蹄疫A型武汉株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用。该试剂盒包括可以与口蹄疫A型武汉株(A/WH/09株)的特异性结合的单克隆抗体5G11作为捕获抗体制成的酶标板和酶标抗体。利用本发明试剂盒进行检测与目前口蹄疫其他毒株均不发生交叉反应。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，能够稳定地检测口蹄疫A型武汉株抗原含量及特异性区分口蹄疫A型武汉株与其他毒株。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种特异性定量检测口蹄疫A型武汉株抗原的酶联免疫检测试剂盒，适用于口蹄疫A型武汉株抗原的特异、快速、准确检测。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。口蹄疫的致死率很低，但是感染率很高。发病的主要症状为：口腔粘膜、舌、唇、鼻镜、蹄叉、乳头等部位发生水疱，破溃形成烂斑，病畜蹄痛卧地、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，妊娠母牛可能流产，而后导致繁殖力降低；猪则以破蹄为最主要症状；山羊和绵羊的症状通常比牛温和。口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和畜产品的生产供应。由于其在世界范围内广泛分布，能感染70多种家养和野生动物，且发病率极高(约为100％)，严重影响畜牧业生产和国际贸易，因而受到各国的高度重视，被世界动物卫生组织(Office International DesEpizooties,OIE)列为法定报告动物疫病。

口蹄疫病毒(FMDV)是小RNA病毒科(picornavi-ridae)，口蹄疫病毒属(aphthovirus)的成员，由一条长约8500个核苷酸的单股、正链RNA和衣壳蛋白组成。病毒衣壳由4种结构蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成，其中VP1和VP3是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒(FMDV)具有多型性、易变性等特点，具有7个血清型，分别为A、O、C、SATI、SATII、SATIII及AsiaI型，各型之间无交叉保护反应。目前国内主要流行的是O型、A型和亚洲1型。

目前测定口蹄疫146S抗原的方法主要有蔗糖密度梯度离心，但该方法操作复杂，需要3天时间完成，耗时较长，且不能区分血清型，更无法对同一血清型不同毒株进行区分，因而，需要开发一种更为特异，灵敏、准确和可靠的检测方法来对口蹄疫不同血清型和毒株进行区分。

目前，酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)是市场上主流的免疫测定技术，已广泛应用于临床检测，快速便捷且灵敏度高，且不需要特殊的仪器设备，可用于口蹄疫146S抗原检测。目前市场上，用于检测口蹄疫抗原的ELISA试剂盒大都采用多克隆抗体，比如中国农业科学院兰州兽医研究所开发的“一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法及其试剂盒和应用”，该试剂盒专利(申请号CN201310017209.4)显示采用了A型口蹄疫兔抗血清作为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记的豚鼠抗血清作为检测抗体，能够将A型与O型、亚洲1型进行区分，但无法区分A型的不同毒株，因此无法对多价疫苗中的每种毒株的口蹄疫146S抗原进行单独定量检测，其主要原因就是在于多克隆抗体针对多种抗原表位，而不同血清型尤其是同一血清型的不同毒株间的同源性非常高，可超过85％，可能仅有少数几十个甚至几个氨基酸序列的差异，可能存在相同的抗原表位，因此依据多克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒不能对同一血清型不同毒株的口蹄疫病毒进行区分并定量检测。单克隆抗体是针对抗原上单一表位筛选制备的抗体，能够同源性识别不同毒株的口蹄疫病毒，是建立区分同一血清型不同毒株的口蹄疫146S抗原定量ELISA试剂盒的基础。

发明内容