[发明专利]一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针及其合成

说明书

本发明提供了一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针及其合成，该探针以4,5‑双取代萘酰亚胺为母体，4‑甲基‑2,3,5,6‑氮杂苯为响应基团，其结构式如(1)所示，4,5‑位的环己二胺有效抑制了分子内扭转，使探针稳定性、亮度得到极大提升。此外，荧光母体的荧光半峰宽小，对温度、极性等均不敏感，在不同微环境下能够保持荧光信号的稳定性。本探针能够与亲二烯体系发生高速的生物正交反应，在与环辛烯结合后荧光增强约9倍，能够用于活细胞内的免洗荧光标记。

技术领域

本发明属于荧光探针领域，涉及一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针及其合成。

背景技术

生物正交反应是一类在生理条件下能够特异性与目标分子发生的高速、高效的化学反应，被广泛应用于生物分子的定点标记。随着研究中对时间分辨率的更高要求，基于狄尔斯-桑尔德反应(Diels-Alder)机制的四嗪与亲二烯的生物正交反应凭借突出的反应速率、正交性、生物相容性，逐渐取代了金属催化的正交反应。因此，借助这类生物正交反应与有机小分子荧光染料，可以实现实时对活细胞内生物大分子的精准标记、成像等。

然而，针对四嗪类生物正交反应的荧光探针仍然匮乏，并且此类探针面临双重的问题。首先，荧光染料的稳定性限制了探针在超分辨领域及单分子检测技术中的应用：目前多数探针以Bodipy与荧光素类染料为荧光团，两类染料虽然荧光量子效率高但是在高强度激光下分子很容易被氧化而发生淬灭。其次，反应后能够实现高荧光增强倍数的探针较少：目前，为了达到活细胞内高的信噪比，洗去未反应的探针是必不可少的步骤，随之而带来时间分辨率的下降、细胞损伤等问题。因此，用于四嗪类生物正交反应的高稳定性免洗荧光探针存在很大需求，从而达到更高空间及时间分辨率下对生物分子的监测。

发明内容

本发明提供一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针，该类染料稳定性高，与亲二烯反应后荧光恢复达到高的荧光增强倍数(9倍)。

本发明提供一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，该方法步骤简单、易于提纯等优点。

本发明一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针，通过萘酰亚胺4,5-位环己二胺的引入达到了荧光稳定性、亮度得到大幅度提升。与Bodipy、荧光素相比稳定性更高，同时保持了亮度高、半峰宽窄等优势。

一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针，该系列荧光探针具有如下结构：

一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，此系列荧光探针合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体BCOEt-NBr的合成：

将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，4-氨基丁酸乙酯盐酸盐溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比1:6-4的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体BCOEt-NBr。

(2)中间体BCOEt-DAC的合成：

将BCOEt-NBr，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入环己二胺。将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比400-50:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体BCOEt-DAC。

(3)中间体BCOOH-DAC的合成

取BCOEt-DAC溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC。

(4)中间体NHSB-DAC的合成