[发明专利]一类生产L-茶氨酸的菌群及其应用

说明书

本发明公开了一类生产L‑茶氨酸的菌群及其应用，该菌群为从茶树无菌组织培养苗中分离到的茶树内生菌，属于黄单胞菌科藤黄杆菌属。本发明的生产L‑茶氨酸的菌群，为首次从茶树中分离的内生菌，在LB培养基上生长良好，28℃培养至对数生长期，向培养基中添加谷氨酰胺和乙胺后继续培养2‑3天，实验组较对照组能够检测到L‑茶氨酸的合成，且合成的茶氨酸能够快速分泌到胞外，分泌效率达90％以上，能够高效合成分泌茶氨酸。本发明的生产L‑茶氨酸方法，以谷氨酰胺和乙胺为底物，操作方法简单，茶氨酸生产效率高，具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一类生产L-茶氨酸的菌群及其应用。

背景技术

茶氨酸(L-Theanine)，是N-乙基-γ-谷氨酰胺，占茶叶中氨基酸总量的50％以上，是茶树中特有的非蛋白质游离氨基酸，也是赋予茶叶特殊风味的主要物质，其含量直接决定茶叶品质。茶氨酸具有放松神经、抗肿瘤、抗抑郁、保护血管、降血压、抑制肥胖及提高机体免疫功能等医药作用，此外，还可以作为功能性食品添加剂应用于食品领域。因此，茶氨酸越来越受到人们青睐，国际市场对其需求量也很大。

目前，生产茶氨酸的方法主要有三种。一种是从茶叶中提取。茶叶中茶氨酸含量较低，且原料来源受限，致使生产成本很高。第二种方法是化学合成法。该方法不仅会导致毒性物质残留，且生产的茶氨酸为D-茶氨酸和L-茶氨酸异构体的混合物，拆分精制工艺复杂。第三种方法是利用微生物及其酶发酵生产茶氨酸。目前报道的能合成茶氨酸的微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌，但这些都是自然界游离微生物，不是从茶树体内分离得到的。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一类生产L-茶氨酸的菌群，为首次从茶树中分离的内生菌，满足使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述菌群在产L-茶氨酸中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一类生产L-茶氨酸的菌群，为从茶树无菌组织培养苗中分离到的茶树内生菌。

所述的生产L-茶氨酸的菌群，分离法为：取数片茶树组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2-3天，待叶片周围长出丰富的菌群后，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养，所获得的菌群即为生产L-茶氨酸的菌群。

所述的茶树品种为安徽省茶树品种“舒茶早”、云南省茶树大叶种“云抗10号”、浙江省茶树品种“龙井43”和“乌牛早”。

所述的菌群为黄单胞菌科藤黄杆菌属。

所述的菌群在生产L-茶氨酸中的应用。

一种生产L-茶氨酸的方法，步骤如下：

1)取数片茶树无菌组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2-3天，待叶片周围长出丰富的菌群后，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养；

2)将菌群在28℃振荡培养至OD₆₀₀为1.0时，向培养液中同时添加终浓度为20mM谷氨酰胺和20mM乙胺，培养7d以上；

3)取得的培养液100℃水浴裂解30min，并于-20℃反复冻融2～3次后，12000rpm，离心15min，获得富含L-茶氨酸的上清液。

步骤2)中，培养10天以上。

所述的茶树品种为安徽省“舒茶早”、云南省茶树大叶种“云抗10号”、浙江省茶叶品种“龙井43”和“乌牛早”。