[发明专利]一种用于铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法

说明书

本发明属于生化分析与药物筛选技术领域。涉及用于铀促排药物体外筛选的方法，尤其涉及一种基于竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)测定促排药物与金属硫蛋白(MT1/2)竞争结合U(VI)或Zn²⁺作用的方法，本方法中，将抗原金属硫蛋白(MT1/2)包被在96孔酶标板上，经封闭、U(VI)或Zn²⁺处理、螯合剂处理、特异性MT1/2单克隆抗体(一抗)与包被抗原结合、酶标二抗与一抗结合、酶反应底物显色及终止反应后，用酶标仪测定吸光度值，通过对药物/无药物处理体系的吸光度值变化情况的统计分析，评价螯合剂竞争结合MT1/2上U(VI)和Zn²⁺的能力强弱。本发明方法具有简便、快速和高通量的优势。

技术领域

本发明属于生化分析与药物筛选技术领域。涉及用于铀促排药物体外筛选的方法，具体涉及一种用于铀(U)(VI)促排药物(螯合剂类)药效及其对机体Zn²⁺稳态影响的体外筛选方法，尤其涉及一种基于竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)测定促排药物与金属硫蛋白(MT1/2)竞争结合U(VI)或Zn²⁺作用的方法，

背景技术

现有技术公开了铀及其化合物在核工业和军事上的用途非常广泛，铀内污染人体的潜在危险及对人体健康的危害问题倍受世界各国所关注。研究显示，铀化合物通过吸入、食入或伤口进入人体后，通常以稳定的6价铀酰离子(UO₂²⁺，U(Ⅵ))的形式存在于体液中，在血液中易与无机酸、有机酸及血浆蛋白结合，经血液循环运输到肾脏和骨骼等主要蓄积靶器官而产生毒性作用。临床实践中采用螯合剂类药物加速体内铀的排出是其主要的治疗措施，但目前仍无有效的药物用于临床，因此寻求高效低毒的铀促排螯合剂一直是研究者们不懈努力的目标。

研究公开了金属硫蛋白(MT)是人体富含半胱氨酸的低分子量的金属结合蛋白，有四种异构体，其中MT1和MT2主要由肝脏和肾脏合成，受Zn²⁺的正向调控，也是维持细胞内Zn²⁺稳态的重要蛋白，它们主要分布于细胞的胞浆中，亦存在于细胞核中，还有少量存在于细胞外液如血浆、胆汁和尿液中，在重金属解毒及微量元素代谢中发挥重要作用。有研究报道，内源性MT通过与重金属镉(Cd²⁺)螯合形成无毒性的Cd-MT复合物由尿排出体外，从而降低Cd²⁺对小鼠的肾毒性；预防性给予ZnSO₄诱导大鼠内源性MT高表达，亦能明显促进尿贫铀(DU(Ⅵ))排出及降低肾DU(Ⅵ)蓄积，对DU(Ⅵ)致肾损伤有较好的保护作用，表明MT亦能通过与U(Ⅵ)结合形成无毒或低毒的U(Ⅵ)-MT螯合物经尿排出体外而发挥机体的自我保护功能。但又有研究发现，血液循环中的Cd-MT复合物还可被肾小管上皮细胞重吸收，在溶酶体内降解分离，释放出游离Cd²⁺直接对细胞的结构和功能造成损伤，提示内源性MT对重金属Cd²⁺的肾毒性具有减轻或加重的双向作用；与之相似，U(Ⅵ)与金属转运蛋白复合物包括U(Ⅵ)-MT复合物通过血液循环运输到肾脏，经肾小球滤过后大部分可被肾小管上皮细胞重吸收，在溶酶体中解离形成磷酸铀晶体，随着该晶体的生长导致溶酶体破坏，释放出游离U(Ⅵ)导致细胞损伤；由此表明内源性MT对机体的保护作用是有限的，必须给予促排药物才能达到更为有效的治疗效果，而螯合剂与内源性MT竞争螯合U(Ⅵ)的作用是影响螯合剂排铀效果的关键因素之一。

迄今为止，已公开有多种基于ELISA法检测生物样品包括血清、血浆、尿液、组织匀浆和细胞上清液等相关液体样本中MT含量的方法，如竞争ELISA法、双抗体一步夹心ELISA法等；以及基于鱼MT含量检测ELISA法用于监测水体生态环境中Cd²⁺等重金属污染程度的方法；还有研究报道，Cd²⁺、Zn²⁺与MT抗体对MT的结合存在竞争作用，等；具有简便、快速、廉价、用药量少、高通量和便于推广应用的优点，但尚未见相关竞争ELISA法用于放射性核素U(Ⅵ)促排药物药效及其对机体Zn²⁺稳态影响的体外筛选的报道。