[发明专利]一种用于铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法

权利要求书

1.一种用于铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于：包括其促排效果的筛选及其对Zn²⁺稳态影响的筛选。

2.根据权利要求1所述的铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于，其包括：将MT1/2抗原包被在酶标板上；4℃孵育过夜后用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭；洗板后加入一定浓度的U(VI)溶液或Zn²⁺溶液，37℃孵育后洗板；加入一定浓度的螯合剂，37℃孵育后洗板；加入特异性MT1/2单克隆抗体，37℃孵育后洗板；加入酶标二抗，37℃孵育后洗板；加入酶反应底物OPD，室温避光孵育后加入终止反应液2mol/L硫酸终止反应，然后用酶标仪在490nm处测定吸光度值。

3.根据权利要求1或2所述的铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于，通过下述步骤进行：

(1)包被：用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)溶解及稀释包被抗原兔肝MT1/2至工作浓度，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜，所述缓冲液为碳酸盐缓冲液；

(2)洗板：以PBST为洗液，洗板3次，每次5min，300μL/孔，弃液拍干；

(3)封闭：以1％牛血清白蛋白为封闭液，200μL/孔，4℃封闭过夜；封闭结束后，弃液拍干；

(4)U(VI)或Zn²⁺处理：加入一定浓度的U(VI)溶液和Zn²⁺溶液，100μL/孔，37℃孵育3h；

(5)洗板：同步骤(2)；

(6)螯合剂处理：加入一定浓度的螯合剂，100μL/孔，37℃孵育0.5～3h；

(7)洗板：同步骤(2)；

(8)加一抗：加入一定浓度的鼠抗MT1/2单克隆抗体(一抗)，100μL/孔，37℃孵育1～3h；

(9)洗板：同步骤(2)；

(10)加酶标二抗：加入1:1000～2000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP(二抗)，100μL/孔，37℃孵育1h；

(11)洗板：同步骤(2)；

(12)显色：加入新鲜配制的OPD底物显色液，100μL/孔，室温避光显色15min；

(13)终止反应：加2mol/L H₂SO₄溶液终止显色反应，50μL/孔；

(14)测定：于酶标仪490nm波长处测定吸光度值A₄₉₀。

4.根据权利要求2或3所述的铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于：所述的U(VI)或Zn²⁺与MT1/2结合后能干扰包被抗原MT1/2与MT1/2单克隆抗体结合，使吸光度值降低50％以上。

5.根据权利要求2或3所述的铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于：当螯合剂有效竞争结合MT1/2上的U(VI)或Zn²⁺进而恢复MT1/2抗原与MT1/2抗体结合的位点时，使吸光度值明显增加；如果螯合剂结合U(VI)或Zn²⁺的能力小于或等于MT结合U(VI)或Zn²⁺的能力，则不能竞争结合MT上的U(VI)或Zn²⁺而无法增加吸光度值；所述吸光度值增加与否用于评价U(VI)促排药物的药效及其对机体Zn²⁺稳态的影响。

6.根据权利要求1～5任一所述的U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于，所述方法中，反应体系中以pH 9.6 0.05～0.1mol/L CBS作为包被缓冲液，包被抗原MT1/2工作浓度为0.6～2μg/mL，MT1/2抗体工作浓度为0.5～2μg/mL，U(VI)溶液和Zn²⁺溶液的工作浓度为150～600μmol/L，U(VI)和Zn²⁺溶液孵育的温度和时间各为37℃孵育3h，螯合剂孵育的温度和时间为37℃孵育0.5～3h，封闭液为含1％牛血清白蛋白的pH7.40.01mol/L磷酸盐缓冲液，酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，洗液为含0.05％Tween 20、pH 7.40.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBST)，显色底物为0.4mg/mL邻苯二胺，以pH 5.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制。