[发明专利]微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法

权利要求书

1.一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抗生素的提取：微波萃取

称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的底泥样品，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液，用超纯水稀释，调节pH值；

所述的指示回收率的内标物为磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃；

(2)富集净化：固相萃取

依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，控制样品过柱流速；富集完后，依次用超纯水和低浓度的甲醇淋洗固相萃取柱，并真空干燥固相萃取柱；最后用甲醇洗脱固相萃取柱，经氮吹仪吹干，获得残渣；将残渣用一定浓度的有机溶剂溶解、定容、超声、过滤后转移至小瓶，待测；

(3)高效液相色谱串联质谱法测定水产养殖底泥中七类15种抗生素的含量

采用内标法，用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测水产养殖底泥中七类15种抗生素；所述的15种抗生素包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类、硝基呋喃类、甲氧苄啶、喹乙醇这七类抗生素；15种抗生素分别为磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SM1、磺胺二甲基嘧啶SM2、磺胺间二甲氧基嘧啶SDM、磺胺甲噁唑SMX、甲氧苄啶TMP、恩诺沙星ENR、环丙沙星CIP、诺氟沙星NOR、呋喃唑酮AOZ、金霉素CTC、土霉素OTC、盐酸多西环素DOX、阿莫西林AMZ、喹乙醇OLA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃这七种内标物指示回收率。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的提取溶剂，是乙腈:磷酸盐缓冲液体积比为1:1的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行萃取，提取底泥中的抗生素；底泥样品过滤所用的筛网为孔径0.25mm的筛网；微波萃取后过滤提取液所用的玻璃纤维滤膜孔径为0.45μm、0.47μm或0.7μm；稀释后的样品pH值调至3-4。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲醇和超纯水用量为5-10mL；淋洗固相萃取柱所用的超纯水和低浓度甲醇水溶液各为5-10mL；真空干燥的时间在20-30min；洗脱固相萃取柱时的流速低于10mL/min。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，富集净化所用的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；样品过柱流速不超过5mL/min；活化固相萃取柱的流速不超过5mL/min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；残渣用有机溶剂溶解、定容后，超声5-10min；用针式滤器过滤至棕色进样小瓶；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，溶解氮吹后残留物质的有机溶剂为甲醇或乙腈，或体积浓度为70-80％的甲醇-水溶液，或体积浓度为70-80％的乙腈-水溶液。