[发明专利]一种柱前衍生-HPLC测定DXS酶催化活性的方法

说明书

本发明提出了一种柱前衍生‑HPLC测定1‑脱氧‑D‑木酮糖5‑磷酸合酶(DXS)催化活性的方法，明确了1,2‑邻氨基苯(OPDA)及其类似物为适宜的衍生化试剂。DXS催化的1‑脱氧‑D‑木酮糖5‑磷酸(DXP)合成反应结束后，加入1,2‑邻氨基苯或其类似物对反应中剩余的反应底物丙酮酸、D‑甘油醛‑3‑磷酸进行衍生化，再以HPLC利用甲醇‑水或乙腈‑水为流动相进行梯度洗脱，紫外检测仪检测，然后通过计算反应体系中丙酮酸和/或D‑甘油醛‑3‑磷酸的消耗量来确定DXS的催化活性。本发明限定的衍生化试剂，衍生化反应条件温和，反应迅速，操作简单，HPLC检测灵敏度高，重现性好，检测结果准确。

技术领域

本发明属于酶研究领域，涉及一种柱前衍生-HPLC测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的方法。

背景技术

萜类化合物又称类异戊二烯，是生物体内广泛存在的一类天然烃类化合物，它们在生物体中发挥着重要的作用，如植物甾醇参与生物膜的构建；泛醌参与呼吸作用；类胡萝卜素及叶绿素的侧链和质体醌参与光合作用；雌激素参与细胞间信号传递过程并可控制个体的生长发育；多萜醇和异戊二烯基团参与蛋白修饰；甜椒醇(capsidiol)等可作为抗菌素及植物抗毒素用于物种间相互防御；赤霉素、脱落酸、细胞分裂素和油菜素内酯调节植物生长发育；维生素A的存在可促进视网膜的正常功能，缺乏则导致夜盲症；维生素D能促进钙、磷在肠内的吸收，维持血钙血磷的平衡，促进骨质的钙化等。同时，植物中所含的其它一些萜类化合物在调节植物与环境的关系上发挥重要的生态功能，如防御食草动物和病原微生物，吸引传粉动物和播种动物，作为中间感应化合物参与中间竞争等。萜类物质还具有抗氧化活性，在人体中可起着延缓衰老和增强免疫力的作用，其中不少萜类化合物还具有很好的药理活性，是中药和天然植物药的主要有效成分，如目前广泛使用的抗疟药物青蒿素、抗心血管疾病的银杏内酯及具有很强抗癌活性的化合物紫杉醇等。

长期以来，生物体内的萜类化合物被认为是由乙酰辅酶A经甲羟戊酸(MVA)而合成，并认为MVA是萜类化合物生物合成的唯一前体，故该生物合成途径被称为MVA途径。但到上世纪九十年代初，人们发现萜类化合物的生物合成除MVA途径外，还存在一条非甲羟戊酸途径，由于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)和2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)是这一新途径中的两个重要中间体，故称为DXP/MEP途径，现称为MEP途径。

最新研究证明，动物(包括人类)主要通过经典的MVA途径来合成其所需的萜类化合物，而人类的一些主要致病菌及原虫，则是利用MEP途径来合成其所必需的萜类化合物，这种途径完全不同于哺乳动物和植物胞浆中的MVA途径。由于该途径合成的类异戊二烯及其衍生物在微生物的代谢过程及其细胞壁合成中至关重要，抑制或切断该途径即可达到抑菌或杀菌的目的，这就为人们提供了一个利用MEP途径中的酶为靶标进行新抗菌活性化合物筛选的强有力的方法，而使用该方法进行筛选的最大优点在于筛选的过程不需考虑选择性。因此，这条新发现的MEP途径在新类型抗菌素的发现方面将具有非常广阔的应用前景，尤其是在当前病菌对现存的各种抗菌素的耐受性日益提高的情况下。目前，对该生物合成途径中的酶及它们的作用机理的研究已成为一个热点，由于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)是MEP途径中的第一个关键酶，也是该途径的第一个关键调控位点，所以对它的研究也倍受重视，而对该酶催化活性测定方法的研究则是所有其它研究开展的基础。