[发明专利]一种柱前衍生-HPLC测定DXS酶催化活性的方法

权利要求书

1.1,2-邻氨基苯(OPDA)及其类似物作为衍生化试剂以柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述类似物包括4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)和2,3-二氨基萘(DAN)。

3.一种利用权利要求1中所述的衍生化试剂以柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)DXS催化反应的反应体系：

将D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)、丙酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及DXS酶加入到缓冲液中，进行孵育；

(2)丙酮酸及D-GAP的衍生化：

步骤(1)催化反应结束后，反应体系中加入所述衍生化试剂，孵育，进行衍生化反应；

(3)反相HPLC检测：

将步骤(2)中得到的样品，经过离心后取上清液，过0.22μM膜，然后进行HPLC检测；

(4)根据HPLC检测结果计算丙酮酸、D-GAP的消耗量，进而得出DXS催化活性及稳态动力学参数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)的反应体系为：以反应总体积50-200μL计，底物D-GAP及丙酮酸的浓度均为1.0-5.0mM；二价金属阳离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺或Zn²⁺，浓度为2.0-10.0mM；ThPP浓度为0.5-2.0mM，酶为微生物源或植物源DXS，用量为0.2-1.0mg/ml；所用缓冲液为40-200mM的Tris-HCl或PBS或柠檬酸或MOPS缓冲液，pH 6.0-8.5；孵育温度为25-40℃，孵育时间为0.5-2h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述衍生化试剂的储备液是以1.0-3.0M盐酸配制为10.0-20.0mM溶液。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作如下：将步骤(1)获得的反应液中加入衍生化试剂50-200μL，孵育温度为40-80℃，孵育时间为0.2-2h。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)的检测体系中，HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200HPLC仪或Waters 1525HPLC仪，色谱柱为4.6x250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为10-50μL；流速为0.5-2.0mL/min；检测波长为240-400nm；柱温为20-40℃；流动相为甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为10-30min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

甲醇/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B；

乙腈/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min,80％流动相B；23min,40％流动相B；

四氢呋喃/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：四氢呋喃；梯度为0min，35％流动相B；15min，60％流动相B；18min，35％流动相B；20min，35％流动相B。