[发明专利]雄性核不育基因及其突变体在杂交育种上的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米杂交育种方法，包括不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及植物FL1基因或其等位基因以及由该基因变异所产生的突变体植株。

本申请是申请日为2014年9月15日的中国专利申请201480041120.4“雄性核不育基因及其突变体在杂交育种上的应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米杂交育种方法，包括不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及玉米ZmFL1基因或其等位基因以及由该基因变异所产生的突变体植株。

技术背景

玉米是我国主要粮食作物，同时在饲用和生物能源中发挥巨大作用，现已成为我国种植面积最大、总产最多的作物。杂种优势能大幅提高作物产量、抗性和品质，玉米是较早利用杂种优势的作物之一，1924年第一个玉米杂交种诞生。玉米杂种优势利用的主要瓶颈是制种过程中母本去雄。商业育种中主要采用两种方式去雄：人工去雄和机械去雄。但两种去雄方式均存在不足：人工去雄不彻底，容易导致种子纯度下降，同时大幅度地提高成本；机械去雄要求上部叶片稀疏的植株结构和平整且面积较大的地块，但我国玉米品种以紧凑型为主，甘肃等西北制种地难以实现整块连片，因此无法采用机械去雄。同时，玉米杂交种生产中存在着常用育种的亲本遗传基础差异不够大，并因此影响到主要育种目标如高产、稳产、抗逆、早熟等的尽快实现。采用雄性不育制种，既能避免由于母本去雄不彻底导致的种子纯度下降的问题，又能取代机械去雄，降低种子生产成本；采用该技术制种最为重要的是获得不育性状彻底、稳定且容易找到恢复系的雄性不育系。玉米质雄性不育易感染叶斑病且难以获得恢复系，而核雄性不育系能克服叶斑病，易于找到恢复系。因此，加强玉米核雄性不育突变体及其控制基因的研究，对玉米杂交育种和生产具有重大意义。

玉米花粉粒壁是花粉粒最外层结构，在受精和花粉发育过程中发挥了重要作用，其发育异常，容易导致雄性不育。花粉粒壁主要由花粉粒外壁和花粉粒内壁两层组成。外壁通常由两层构成：外壁外层和外壁内层。外壁外层包含柱状层，顶盖层以及填充在内的含油层(花粉包被)构成，内壁与原生质膜相连。

花粉粒外壁具有多种作用：为小孢子原生质提供结构和物理支撑；使花粉粒免受干燥、高温、紫外线等外界因素的破坏；阻止花粉粒水分散失；保持原生质膜的完整性。花粉粒外壁的主要成分为孢粉素，它是一种坚韧和耐腐蚀的结构，因此能对外界各种逆境产生抗性。化学成分上，孢粉素是一种复杂的生物聚合物，主要包括长链脂肪酸、长链脂肪族物和苯酚复合物。花粉粒外壁的形成是一个十分复杂的过程，在绒毡层和小孢子共同参与下完成的。四分体时期，小孢子被胼胝质壁包裹，随后在胼胝质酶的作用下从四分体释放，胼胝质是形成初生外壁的模板。初生外壁由小孢子分泌的多糖类物质构成，为孢粉素沉积提供一种理想结构和必须的酶类物质。绒毡层是孢粉素前体物质合成场所，由孢粉素前体物质分泌载体和运输载体运送到初生外壁上不断沉积，最后形成完整的外壁结构。这一系列过程都受到严格的遗传调控，任何一个步骤发生突变都会导致外壁形成受阻，从而导致雄性不育。

近年来，利用突变体已克隆多个花粉粒外壁形成异常且雄性不育的基因。

雄水稻性不育突变体-cyp704B2表现为绒毡层过分膨胀，花粉粒外壁缺失，表皮未发育完全。化学成分分析表明：突变体角质含量显著下降。CYP704B2主要在水稻花药发育第八期至第十期的绒毡层和小孢子中表达。酵母异源表达分析证明CYP704B2能够催化16C 和18Cω-羟基化脂肪酸的合成，从而影响花药表皮和花粉粒外壁的形成。该催化机制在从苔藓到被子植物的植物中具有保守性。

雄性不育突变体-defective pollen wall(dpw)，其花药发育受到破坏，花粉粒外壁形状不规则。化学分析表明突变体角质单体和表皮蜡质含量显著降低，同时脂肪酸和脂肪醇含量也降低。DPW在绒毡层细胞和小孢子中表达。重组DPW蛋白酶可以以脂肪酰基载体蛋白为底物，将C16脂肪酸还原为其相应的脂肪醇，其与脂肪酰基载体蛋白为底物的亲和力是以C16:0乙酰辅酶A为底物的270倍以上。DPW蛋白以其N端运输肽的介导作用，定位于质体中。而且DPW能够互补拟南芥ms2表型，证明它可能是MS2的同源蛋白。