[发明专利]一种温控裂解质粒及其构建以及在菌蜕制备中的应用

说明书

本发明涉及一种温控裂解质粒及其构建以及在菌蜕制备中的应用，其特征在于：所述温控裂解质粒为具有卡那霉素抗性的温控裂解质粒220E‑Kn，该220E‑Kn的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，与现有技术相比，本发明具有如下优点：所构建的温控裂解质粒具有卡那霉素抗性，可用于对卡那霉素敏感的致病菌的菌蜕构建，同时，相比于带有卡那霉素抗性的自杀质粒，本发明构建的质粒只需一轮抗性筛选即可获得用于菌蜕制备的阳性菌株，操作简单方便、利于推广，并且，本发明提供的质粒具有较小的基因组(3887bp)，容易在宿主菌中稳定复制遗传，可靠性更高。

技术领域

本发明涉及一种质粒载体，特别涉及一种卡那霉素抗性温控裂解质粒及其构建方法，以及其在制备大肠杆菌菌蜕中的用途，属于基因工程领域。

背景技术

温控裂解质粒是一种同时含有温控表达元件和裂解酶基因编码框的原核表达质粒，可在特定的诱导温度下大量表达裂解酶，使宿主菌发生穿孔、内容物外泄，进而形成失活的细菌外壳，也即菌蜕。菌蜕保留了和原菌几乎一样的外壳结构，具备完整的外膜组分的免疫原性，因而在免疫学上具有重要的应用价值：一方面菌蜕可作为一种新型的灭活疫苗，相比传统的甲醛等方式灭活的疫苗，具有更好的免疫原性；另一方面，菌蜕自带的外壳包裹的中空结构又可成为其他基因工程疫苗甚至是药物的良好载体。

利用温控裂解质粒制备菌蜕具有天然的优势：导入温控裂解质粒的宿主菌只需培养到对数生长期后，转移至特定温度(42℃)下诱导培养，即可生成菌蜕，操作简单且无需额外成本；而携带其他表达调控元件的裂解质粒则需要加入IPTG等化学药物来诱导菌蜕生成，成本高且不利于大规模发酵制备。

将温控裂解质粒导入宿主菌需要有抗性基因作为筛选阳性转化子的标记，目前应用较多的温控裂解质粒是利用pBV220载体自带的氨苄霉素抗性作为筛选标记，此外，也有将氯霉素抗性导入pBV220的报道。王兴龙等人报道的卡那霉素抗性温控裂解质粒则是以自杀质粒pBK-CMV-SacB为母体，通过导入pBV220上的温控元件形成，该质粒需经过正负向两轮筛选才可获得不带抗性的菌壳疫苗株，操作难度较大，且自杀质粒本身基因组庞大，较难导入宿主菌并在宿主菌中实现稳定遗传，因而不利于推广。随着各种新型致病菌耐药现象越来越严重，开发便于推广的具有新型抗性基因标记的温控裂解质粒，成为新型致病菌菌蜕制备的关键。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种新的具有卡那霉素抗性的温控裂解质粒。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状提供一种构建具有卡那霉素抗性的温控裂解质粒的方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述具有卡那霉素抗性的温控裂解质粒在制备菌蜕中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该温控裂解质粒，其特征在于：所述温控裂解质粒为具有卡那霉素抗性的温控裂解质粒220E-Kn，该220E-Kn的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明为解决第二个发明目的而提供一种构建如上述的温控裂解质粒的方法，其特征在于：包括有如下步骤：

(1)以噬菌体PhiX174RFI DNA为模板，Elysis-F2、Elysis-R2为引物，扩增出噬菌体PhiX174裂解基因E，连接于pEasy-T simple克隆载体，经测序无误后，通过EcoR I和SalI双酶切，与相同酶切的pBV220载体连接，获得携带裂解基因E的pBV220，命名为220E；

(2)以构建好的220E质粒为模板，以220F、220R为引物，通过PCR反向扩增，获得线性化的、两端带有重组臂的220E质粒；以携带卡那霉素抗性基因的pET30(a)质粒为模板，该携带卡那霉素抗性基因的pET30(a)质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，并以Km-F、Kn-R为引物，通过PCR扩增获得两端带有重组臂的卡那霉素抗性基因220E-Kn；