[发明专利]一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法

说明书

本发明涉及一种从黄芪中富集多肽并进行鉴定的方法，是将经鉴定无误的干燥黄芪切片经醇液超声提取、过滤、浓缩、萃取、有机试剂富集黄芪中的多肽并通过烷基化处理、质谱分析及De Novo分析鉴定其中的二硫键多肽。本发明成功地将传统的植物化学分析方法、生物化学方法及质谱方法相结合进行多肽富集及检测，无需脱盐、超滤分离、特殊色谱柱填料等操作，步骤少、操作简便，为现代植物多肽的研究提供了技术参考及指导。

技术领域

本发明属于分离分析及生物技术领域，具体涉及一种将传统植物提取方法与生物技术结合来富集鉴定二硫键多肽的方法。

背景技术

黄芪，为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge的干燥根。始载于《神农本草经》，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等作用。现代医学研究其具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗病毒、抗损伤、降血糖、治疗代谢紊乱等活性作用。研究最多的主要活性成分为黄酮类、皂苷类、多糖类成分。

自然界中存在着大量的多肽类化合物，前人更多地关注于动物体中的多肽、蛋白类成分，而在植物中主要研究黄酮、蒽醌、三萜、皂苷、生物碱等类化合物。随着现代分离及分析技术的飞跃发展，越来越多的植物中多肽类化合物被鉴定得到，且实验研究发现许多植物多肽类成分具有较强的生物活性，这为新药研发带来了更多的可能性。目前，研究发现植物多肽具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、提高免疫活性、降糖、修复神经损伤等方面的活性，继而开发了一些具有显著疗效的临床药物。

自然界中存在的多二硫键肽(常含2-4对二硫键，分子量2500-4000)因为结构稳定、空间结构特殊而多具有重要的生理功能以及优异的成药特性。与线性多肽相比，多二硫键肽的种类有限，在动植物中分布稀疏，难以被发现；其结构稳定性高，骨架长，难以被通用的蛋白质组学手段进行序列及结构测定；尤其是多对二硫键形成的二硫键桥环难以被准确测定。这些因素，导致二硫键多肽的发现和结构鉴定成为活性多肽研究领域的一个难点。而植物多肽类药物具有广阔的发展前景，由于植物中成分复杂，多肽含量较少，有效分离纯化的方法较少等原因导致其发展受到了一定的限制，为改善这一限制条件，越来越多的分离、纯化、鉴定方法应运而生，并且取得了良好的效果。目前，多肽、蛋白的分离纯化方式还是需要依靠特殊处理，如：尿素提取、酶法制备等，操作较为繁琐，后处理过程较多。因此，发展一种有效、简便、快速分离纯化的方法是一项非常有价值的研究课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)制备黄芪提取液；

b)向所述黄芪提取液中加入萃取剂A，得到含有萃取剂A的萃取液和不含萃取剂A的萃取液；

c)向所述不含萃取剂A的萃取液中加入醇类萃取剂B，得到含有醇类萃取剂B的萃取液和不含醇类萃取剂B的萃取液；

d)将所述含有醇类萃取剂B的萃取液浓缩制得干燥物I,然后使所述干燥物I中与混合萃取液C接触，将所得沉淀物浓缩制得干燥物II；

e)将所述干燥物II分成两等份干燥物II-1和干燥物II-2；

f)将溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应，制得前驱体1；

g)将所述前驱体1与碘乙酰胺接触，进行烷基化反应得到前驱体2；

h)向所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应结束后除盐并进行干燥，得到干燥物III；

i)采用质谱技术对所述干燥物II-1和所述干燥物III进行多肽检测分析

在优选的实施方式中，将所述干燥物II-1的质谱数据用作所述干燥物III的二硫键的烷基化多肽质谱数据的内在对照。