[发明专利]一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法

权利要求书

1.一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

a）制备黄芪提取液；

b）向所述黄芪提取液中加入萃取剂A，得到含有萃取剂A的萃取液和不含萃取剂A的萃取液；

c）向所述不含萃取剂A的萃取液中加入醇类萃取剂B，得到含有醇类萃取剂B的萃取液和不含醇类萃取剂B的萃取液；

d）将所述含有醇类萃取剂B的萃取液浓缩制得干燥物I, 所述干燥物I采用去离子水混悬形成含有干燥物I的溶液，所述含有干燥物I的溶液与混合萃取液C接触萃取，将形成的中间沉淀层浓缩制得干燥物II；

e）将所述干燥物II分成两等份干燥物II-1和干燥物II-2；

f）将溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应，制得前驱体1；

g）将所述前驱体1与碘乙酰胺接触，进行烷基化反应得到前驱体2；

h）向所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应结束后除盐并进行干燥，得到干燥物III；

i)采用质谱技术对所述干燥物II-1和所述干燥物III进行多肽检测分析；

其中，

所述黄芪提取液是固体黄芪样品的乙醇-水溶液，其中乙醇在所述乙醇-水溶液中的体积比为70%；

所述固体黄芪样品由粉碎黄芪切片获得；

所述固体黄芪样品与乙醇-水溶液的质量体积比为0.125kg/L；

所述萃取剂A选自乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷中的至少一种；

所述醇类萃取剂B为正丁醇；

所述混合萃取液C由正丁醇和二氯甲烷组成；

所述萃取剂A与所述黄芪提取液的体积比为1:1；

所述醇类萃取剂B与所述不含萃取剂A的萃取液的体积比为1:1；

所述混合萃取液C中的正丁醇与二氯甲烷的体积为：4~5:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述干燥物II-1的质谱数据用作所述干燥物III的二硫键的烷基化多肽质谱数据的内在对照。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合萃取液C与所述含有干燥物I的溶液的体积比为1:4。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f）中，溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在50~60℃下进行0.5~1.5小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤f）中，所述溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在水浴条件下进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤g）中，所述前驱体1与碘乙酰胺接触反应在常温下进行3~5小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤h）中，所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应在常温下进行0.5~1.5小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱技术包括Nano-LTQ-OrbitrapLC-MS/MS或Q-TOF LC-MS/MS中至少一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述质谱技术是Nano-LTQ-Orbitrap LC-MS/MS。