[发明专利]一种有效垂钓水稻启动子DNA结合蛋白的方法

说明书

本发明提供一种有效垂钓水稻启动子DNA结合蛋白的方法，包括利用含有NP‑40,NaCl,PMSF等的蛋白提取缓冲液提取水稻叶片天然总蛋白，进一步用生物素标记引物并扩增启动子DNA，将启动子DNA与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，在此基础上，将启动子DNA与磁珠的复合物与水稻叶片天然总蛋白孵育，得到与启动子DNA结合的蛋白。本方法适用于水稻不同品种的启动子DNA结合蛋白的研究，也可用于研究不同植物启动子DNA的结合蛋白。建立了一种高效、简易获得植物启动子DNA结合蛋白的技术。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种有效垂钓水稻启动子DNA结合蛋白的方法。

背景技术

基因表达是生物体进行生命活动的基础过程，是机体响应的最初变化。在生物体中，基因表达由生物体内反式作用因子(转录因子)作用于顺式作用原件(启动子区域)所决定，基因的表水平与其启动子的活性密切相关，启动子的活性又受到了转录因子的调控。转录因子是一类反式作用因子，转录因子在动植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的调控作用。

在高等植物中，转录因子不仅参与调控植物体的生长发育和形态建成等生命活动中的重要过程，转录因子还调控着植物体的次生代谢和抗逆反应等过程。此外，植物中可编码蛋白的基因中具有众多基因编码的蛋白为转录因子蛋白，转录因子的数量和种类繁多，表明了植物转录调控的特殊性和复杂性。因此，研究高等植物在不同环境条件下，基因启动子的转录因子对于揭示植物基因响应的转录调控过程具有十分重要的意义。

针对此，获取目标基因启动子的转录因子，对于研究目标基因的表达调控行为具有十分重要的作用。酵母单杂交是一种筛选与靶元件有特异结合区域的转录因子的经典方法，该法能够有效检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用。然而此法需要构建不同目标基因与转录激活区(Activation domain AD)的融合表达载体，过程繁琐，其阳性互作子的筛选也较为繁琐，操作条件要求较高，限制其在广泛使用。因此，需要开发一种有效获得结合在目标启动子DNA的转录因子的方法。

发明内容

本发明提供一种有效垂钓水稻启动子DNA结合蛋白的方法，该法能够一次性获得结合在目标启动子DNA上的转录因子，可用于研究目的基因的表达调控因子。

一种有效垂钓水稻启动子DNA结合蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）水稻天然总蛋白的提取；

（2）启动子DNA的扩增与生物素标记；

（3）生物素标记的启动子DNA与链霉亲和素偶联磁珠孵育；

（4）启动子DNA的结合蛋白垂钓与分离。

步骤（1）水稻天然总蛋白的提取的具体步骤为：取3~5 g的水稻鲜叶片于预冷的研钵中，并在液氮条件研磨成粉末；将粉末快速转移至预冷的50 ml离心管中，加入组织粉末1.5~2倍体积的蛋白提取缓冲液，漩涡震荡充分混匀后冰浴15~30min，4℃条件下旋转孵育45~60 min，4℃ 15000g离心15~20 min，取上清用灭菌的Miracloth过滤上清液中残渣，过滤后的上清液进一步4℃ 15000g离心15~20 min，并用灭菌的Miracloth再次滤去残留的少量残渣，最终得到水稻天然总蛋白溶液，4℃保存备用。

步骤（2）启动子DNA的扩增与生物素标记的具体方法为：针对研究的目标启动子设计正反向扩增引物，其中正向引物的5’端进行生物素(biotin)标记，以水稻DNA为模板扩增得到带有生物素标记的启动子DNA，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化启动子DNA，-20℃保存备用。

所述目标启动子为PAL启动子，所述正向引物序列为：5'-GGTAGTGCTAGATATGAAGGGCTGC-3'，反向引物序列为5'-GCACGAGGAGAAGAGAGGATTCGAT-3'。