[发明专利]一种有效垂钓水稻启动子DNA结合蛋白的方法

权利要求书

1.一种有效垂钓水稻启动子DNA结合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）水稻天然总蛋白的提取；

（2）启动子DNA的扩增与生物素标记；

（3）生物素标记的启动子DNA与链霉亲和素偶联磁珠孵育；

（4）启动子DNA的结合蛋白垂钓与分离；

步骤（1）水稻天然总蛋白的提取的具体步骤为：取3~5 g的水稻鲜叶片于预冷的研钵中，并在液氮条件研磨成粉末；将粉末快速转移至预冷的50 ml离心管中，加入组织粉末1.5~2倍体积的蛋白提取缓冲液，漩涡震荡充分混匀后冰浴15~30min，4℃条件下旋转孵育45~60 min，4℃ 15000g离心15~20 min，取上清用灭菌的Miracloth过滤上清液中残渣，过滤后的上清液进一步4℃ 15000g离心15~20 min，并用灭菌的Miracloth再次滤去残留的少量残渣，最终得到水稻天然总蛋白溶液，4℃保存备用；

步骤（2）启动子DNA的扩增与生物素标记的具体方法为：针对研究的目标启动子设计正反向扩增引物，其中正向引物的5’端进行生物素(biotin)标记，以水稻DNA为模板扩增得到带有生物素标记的启动子DNA，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化启动子DNA，-20℃保存备用；

所述目标启动子为PAL启动子，所述正向引物序列为：

5 '-GGTAGTGCTAGATATGAAGGGCTGC-3 '，

反向引物序列为5 '-GCACGAGGAGAAGAGAGGATTCGAT-3 '；

步骤（3）生物素标记的启动子DNA与链霉亲和素偶联磁珠孵育的具体操作步骤为：取15~20 μL链霉亲和素偶联磁珠于1.5 ml的无菌离心管中，将离心管置于磁力架中静置2~3min，保存离心管在磁力架中，小心吸去上清；取出离心管，加入60~80 μL的Bindingsolution轻轻重悬磁珠，重悬后将离心管重新置于磁力架中静置2~3min，保存离心管在磁力架中，小心吸去上清；取出离心管，加入60~80 μL的Binding solution轻轻重悬磁珠，加入等体积且总量为10~15 pmole的生物素标记启动子DNA，轻轻混匀后置于旋转混匀器中，室温下孵育3~4 h；孵育完毕后，取出离心管至于磁力架中静置2~3min，保存离心管在磁力架中，小心吸去上清；取出离心管，加入120~160 μL的Washing solution轻轻重悬磁珠，重悬后将离心管重新置于磁力架中静置2~3min，保存离心管在磁力架中，小心吸去上清；取出离心管，加入120~160 μL的无菌双蒸水轻轻重悬磁珠，重悬后将离心管重新置于磁力架中静置2~3min，保存离心管在磁力架中，小心吸去上清；取出离心管，磁珠用15~20 μL蛋白提取缓冲液重悬；其中Binding solution和Washing solution来自赛默飞世尔科技有限公司的Dynabeads ® kilobaseBINDER ™ Kit；

步骤（4）所述启动子DNA的结合蛋白垂钓与分离具体操作步骤为：将步骤（3）重悬的含有生物素标记的启动子DNA的磁珠加入步骤（1）所获得的水稻天然总蛋白溶液中后置于旋转混匀器中，4℃下孵育3~4 h；孵育完毕后，取出离心管至于磁力架中静置2~3min，保存离心管在磁力架中，小心吸去上清；用120~160 μL的蛋白提取缓冲液洗涤磁珠2次，此过程保持离心管放置于磁力架中；洗涤完毕后，取出离心管，加入15~20 μL的2× SDS buffer重悬磁珠，100℃热煮8~10min后取出静置至室温，置于磁力架中静置2~3min，慢慢吸出上清液，得到启动子DNA结合蛋白的溶液，采用10%v/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；

所述2× SDS buffer包含以下终浓度的成分：20%v/v甘油，0.02%w/v溴酚蓝，4%w/vSDS，0.2 M Tris•Cl pH 6.8，200 mM DTT；

所述蛋白提取缓冲液包含以下终浓度的成分：50 mM Tris·Cl pH 7.5；150 mM NaCl；1 mM EDTA pH 8.0；0.1%v/v Nonidet P-40；1%v/v Triton X-100；1mM PMSF；1×cOmpleteProtease Inhibitor cocktail。