[发明专利]一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用

说明书

本发明公开了一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用，包括以下步骤：(1)紫花苜蓿SE1基因的克隆及序列分析；(2)生物信息学分析；(3)亚细胞定位；(4)原核表达；(5)苜蓿鲨烯环氧酶MsSE1的表达；(6)构建MsSE1基因的超表达载体及对紫花苜蓿遗传转化。本发明通过建立高效的遗传转化体系将鲨烯环氧酶基因转入紫花苜蓿中过表达，提高了转基因苜蓿体内的总皂甙的含量，为培育高皂甙含量的苜蓿提供育种材料。

技术领域

本发明涉及植物皂甙合成相关的限速酶基因领域，特别是涉及一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用。

背景技术

鲨烯环氧酶，又称鲨烯单加氧酶，在甲羟戊酸(MVA)途径中催化鲨烯C＝C双键的环氧化反应，生成2,3-氧化鲨烯。这一反应生成了甾醇及三萜类物质的前体物质，并且是三萜皂甙合成的途径中的第一个氧化反应，故鲨烯环氧酶的活性和含量决定了下游产物的产量。在三萜代谢途径中，鲨烯环氧酶(Squalene epoxide，SE)的作用至关重要。鲨烯环氧酶具有氧化还原反应所需的重要辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adeninedinucleotide，FAD)的结合位点，该位点是皂苷生物合成途径中关键酶所包含的重要结合位点。植物一般含两个或两个以上类型的SE基因。在模式植物拟南芥中已发现6个SE基因并具有不同的表达模式，其中SE1、SE2、SE3编码的蛋白已被鉴定为鲨烯环氧酶，具有相应的功能，豆科模式植物蒺藜苜蓿中也发现两种SE基因。有研究表明，当体外诱导剂诱导SE基因的表达量升高，三萜皂苷的生物合成量也随着升高，而降低SE的表达量，三萜皂苷的合成则受到抑制。因此，SE被认为是皂苷生物合成途径中的一个非常重要的调控限速酶基因。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上种植面积最大，分布范围最广泛的优质、高产豆科牧草，被誉为“牧草之王”。苜蓿不仅营养丰富，其次生代谢产物苜蓿皂甙(alfalfa saponins)被认为是苜蓿的药用功能的主要来源。苜蓿皂甙具有良好的降胆固醇、降血脂的功效，还有抗炎、抗癌、抗菌、杀虫等药用及生物活性。目前苜蓿皂甙的提取物被广泛应用于食品、保健品和医药等多个领域，具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用。通过建立高效的遗传转化体系将鲨烯环氧酶基因转入紫花苜蓿中过表达，提高了转基因苜蓿体内的总皂甙的含量，为培育高皂甙含量的苜蓿提供育种材料。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，包括以下步骤：

(1)紫花苜蓿SE1基因的克隆及序列分析；

(2)生物信息学分析；

(3)亚细胞定位；

(4)原核表达；

(5)苜蓿鲨烯环氧酶MsSE1的表达；

(6)构建MsSE1基因的超表达载体及对紫花苜蓿遗传转化。

其中，所述步骤(1)具体为，根据NCBI中已知的的截型苜蓿的鲨烯环氧酶基因的CDS序列，利用Primer 5.0设计1对引物P1和P2，如SEQ ID NO:1-2所示；以紫花苜蓿第一链cDNA为模板进行PCR扩增；PCR程序为94℃5min；94℃30sec；55℃30sec；72℃2min；72℃5min；反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，然后切胶回收；将回收产物连接到pEASY-T3克隆载体上并将重组质粒转化至Trans-T1大肠杆菌感受态细胞内；用卡那抗生素筛选菌落，挑取阳性菌落进行测序鉴定。