[发明专利]一种产D-泛解酸内酯水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种产D‑泛解酸内酯水解酶的基因工程菌，所述工程菌的构建方法为：将D‑泛解酸内酯水解酶的编码基因转入宿主乳酸克鲁维酵母细胞中，制得所述工程菌；所述工程菌内含有重组载体pZL505‑DL的核苷酸片段，所述的DL序列如SEQ ID NO:1所示。本发明解决了现有技术中存在的D‑泛解酸内酯水解酶表达量低的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种产D-泛解酸内酯水解酶的基因工程菌的构建方法及其应用。

背景技术

随着分子生物学理论研究的不断深入和分子生物学手段的不断创新，基因工程技术得以迅速发展，取得了令人瞩目的成绩。作为基因工程技术的重要内容，基因表达技术渗透到了工业、农业以及生命科学的各个领域，受到人们的广泛重视。根据外源基因表达宿主的不同，目前，已发展的基因表达系统有大肠杆菌表达系统、哺乳动物表达系统、酵母表达系统等。其中酵母表达系统具有操作简单、易于培养、生长速度快、成本低等优点，还具有大肠杆菌表达系统所不具备的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，因此得到越来越广泛的应用。

乳酸克鲁维酵母遗传背景清晰且在遗传操作方面技术成熟，已经被美国FDA认证是食品安全级微生物，其优良的蛋白表达系统在食品用酶和药用蛋白生产中得到广泛应用。

D-泛解酸内酯水解酶是化学酶法生产D-泛酸钙的专用酶，在泛酸钙的生产中发挥着重要作用。目前利用化学拆分法生产泛酸钙占据主导体位，但化学法在泛酸钙的生产分离过程中会产生环境污染问题和手性拆分剂的毒性问题，与化学法相比，化学酶法更符合环保的要求且成本较低。在化学酶法中，产D-泛解酸内酯水解酶的原始菌发酵产量较低，例如汤一新等筛选出一株产D-泛解酸内酯水解酶的菌株的生产水平为4.65U/L(汤一新,孙志浩,华蕾,等.D-泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究[J].微生物学报,2002,42(1):81-87.)，于明锐等筛选的菌株Fusarium sp.BU-011的生产水平为410U/L发酵菌体(YuM R,Tan T W.Optical resolution of racemic pantolactone by Fusarium sp.BU-011with high lactonohydrolase activity[J].Process Biochemistry,2005,40(8):2609-2614.)，因此选用发酵优势强的菌株对D-泛解酸内酯水解酶基因进行异源表达来提高酶活表达量，具有较高的工业应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种产D-泛解酸内酯水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明解决了现有技术中存在的D-泛解酸内酯水解酶表达量低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种产D-泛解酸内酯水解酶的基因工程菌，所述工程菌的构建方法为：将D-泛解酸内酯水解酶的编码基因转入宿主乳酸克鲁维酵母细胞中，制得所述工程菌；所述工程菌内含有重组载体pZL505-DL的核苷酸片段，所述的DL序列如SEQ ID NO:1所示。

所述宿主为乳酸克鲁维酵母GG799。

一种产D-泛解酸内酯水解酶的基因工程菌的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

(1)以合成的DL序列为模板，利用SEQ ID NO:2所示的序列为上游引物，SEQ IDNO:3所示的序列为下游引物通过反应获得产物，再用Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ对PCR产物和pZL505载体进行双酶切后连接获得重组载体pZL505-DL；

(2)利用大肠杆菌感受态细胞扩增所述重组表达载体并收集扩增产物，将所述扩增产物用SacⅡ进行酶切后转化宿主细胞获得基因工程菌。

一种产D-泛解酸内酯水解酶的基因工程菌的应用，用于水解D-泛解酸内酯或拆分DL-泛解酸内酯。