[发明专利]一种避孕的工程菌株栓塞和胶囊的制备方法

说明书

本发明公开一种避孕的工程菌株栓塞和胶囊的制备方法，其特征是利用减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性，携带人源毒素DNase I达到杀伤精子的作用。其特点通过与精子细胞结合，减弱精子的活力甚至将精子细胞杀死，实现避孕的作用，制剂形式为阴道栓塞，制作简单，使用方便，成本较低。

技术领域

本发明涉及一种药物的制备方法，尤其涉及一种避孕的工程菌株栓塞和胶囊的制备方法。

背景技术

脱氧核糖核酸酶I(Deoxyribonuclease I，DNase I)是一种特异性DNA水解酶，由260个氨基酸组成的单体糖蛋白，包括两个二硫键(Cys101-Cys104，Cys173-Cys209)和两个潜在的N-连接糖基化位点(Asn18和Asn106)。在Ca²⁺和Mg²⁺等二价金属离子存在的中性pH值条件下能水解双链DNA生成5'磷酸末端和3'羟基末端的寡核苷酸。DNase I除了作为一种消化酶，参与食物来源DNA的降解；随研究的深入，发现内源性DNaseⅠ参与细胞凋亡过程中DNA降解生成DNAladder，同时外源性DNase I可以通过与其细胞表面手提——非阳离子依赖性甘露糖-6磷酸/胰岛素样生长因子(CI-MPR)，作为转录因子上调与细胞凋亡密切相关的Fas基因表达；并且，细胞坏死过程中，血浆纤溶系统激活，协同DNase I进入坏死细胞并在核附近聚集，高效水解坏死细胞染色质DNA。

本发明构建了Abvec-Igk-DNase I重组表达载体，采用减毒鼠伤寒沙门菌VNP20009作为表达菌株。减毒鼠伤寒沙门氏菌具有良好的细胞穿梭性且耐酸，为重组菌株在阴道中发挥作用提供了基本条件。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种分泌表达人源毒素的DNase I的减毒鼠伤寒沙门菌VNP20009的制备方法及其在女性避孕中的应用。

一种避孕的工程菌株栓塞和胶囊的制备方法，其步骤如下：

一、Abvec-Igk-DNase I重组质粒构建：

1、以pET302-DNAse I为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列为引物，经PCR扩增获得SEQ ID No.1所示的DNase I片段；

2、采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取Abvec-Igk(SEQ ID No.2)质粒；

3、酶切

Abvec-Igk，DNase I酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；

4、酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec-Igk质粒中；

5、酶连

酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5:1和10:1,16℃过夜；

6、转化

(1)从-80℃冰箱中取出100μL Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；

(2)加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min；

(3)42℃水浴中热激60s后迅速置于冰上冷却2-4min；

(4)向管中加入800μL SOC培养基，混匀后37℃，180rpm振荡培养1h，使菌体恢复正常生长状态，4000rpm，离心1min，弃上清800μL，留100μL菌液，混匀；