[发明专利]一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用

说明书

本发明公开了一种检测肝癌耐药株细胞的核酸适体及其应用。同现有技术相比，本发明的优点在于：制备的核酸适体能特异性识别肝癌耐药株细胞并具有较好的亲和力、低免疫原性、分子量小、能够体外化学合成、可以对核酸适体的不同部位进行修饰和取代。同时，具有序列稳定，便于保存，方便标记等优势。采用本发明的核酸适体进行肝癌耐药株细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

技术领域

本发明涉及一种可用于检测肝癌耐药株细胞的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的原发性肝肿瘤，是癌症死亡的第三大原因，其发病率增加主要与肝硬化丙型肝炎病毒(HCV)相关的高发病率有关。肝癌是恶性程度高、预后差的疾病，在我国是第二大恶性肿瘤，我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45％。

随着医学科技的进步，我国原发性肝癌的治疗取得了长足的进步，形成“以手术为主综合治疗”的治疗原则，提高了肝癌的整体疗效，延长患者的生存时间，进一步改善患者的生活质量。其中化疗是重要的治疗方法之一，但由于化疗的严重副作用以及肿瘤多药耐药性(multiple drug resistance,MDR)的存在使肝癌的化疗效果受到严重影响。多药耐药性(MDR)定义为癌细胞对一种化学治疗药物产生耐药性的同时，伴有对其他具有不同结构和作用机制的化学治疗药物产生交叉的耐药性。具体而言，一旦癌细胞获得对结构和功能上无关的一些药物的抗性，无论癌细胞是否曾经暴露在这些药物中，那么它们就已经具有MDR表型。一旦癌细胞表现出多药耐药性，那么化疗药对癌细胞的抗癌作用就会降低。

发展识别多药耐药性肝癌的发生发展过程中关键蛋白的分子探针将有助于我们从分子水平上了解肿瘤多药耐药的机制，为实现多药耐药性肝癌的诊断和靶向治疗提供新的分子工具。利用核酸适体特异的靶向性，将治疗性药物递送至癌细胞甚至逆转肿瘤的多药耐药性，已经成为提高化疗疗效并减少或消除药物毒性的有前景的方法。

核酸适体(Aptamer)是短的、有着独特三维结构的单链寡核苷酸，其具有优于常规抗体的几个优势，例如制备简单、成本低、靶标广泛(从小分子、肽、蛋白质、到整个细胞都能进行高亲和力、高特异性识别与结合)、组织穿透能力强、分子量小、免疫原性低、毒性低以及易修饰等。靶向癌症相关受体的核酸适体可以选择性地将治疗性物质(抗癌药物、siRNA、miRNA和药物载体)递送至肿瘤内区室，进行肿瘤的杀伤。核酸适体通常是通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)在体外筛选所得。SELEX技术的基本步骤有：(1)文库的制备,一般是合成10¹²～10¹⁵数量的随机单链库；(2)与靶物质孵育，洗脱不结合的链，把与靶物质结合的链进行反筛，洗掉非特异性结合的链，如此反复筛选，直到筛选到亲和力最高特异性最强的寡核苷酸链；(3)收集与靶物质结合的链进行PCR扩增，然后纯化。

Cell-SELEX是指以活细胞为靶标，进行适配体的筛选的一种SELEX技术。cell-SELEX技术提供了鉴定针对已知生物标志物的适配体和细胞膜表面上的新生物标志物的机会。在cell-SELEX中，靶分子具有其自身的天然构象，这使得用于治疗和诊断应用的适配体开发更容易。它还减轻了处理靶分子构象的复杂性，并增加了找到有效适配体的可能性。另外，由于靶分子在cell-SELEX中锚定于细胞表面，因此不需要纯化靶标或将靶分子固定在固体支持物上。由于这些优势，cell-SELEX已广泛用于获得针对癌症细胞、肿瘤相关蛋白、寄生虫、病毒感染细胞和全细胞等靶标的高度特异性适配体。