[发明专利]瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒

说明书

本发明属于突变或遗传工程；遗传工程涉及的DNA或RNA，载体技术领域，公开了一种瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒，提供了瓢鸡IRX1基因Mbo II和Ava II的2个检测标记。本发明首次采用位置克隆技术，在全基因组关联分析的基础上，通过对相关区间内全部基因的序列测定和遗传变异分析，揭示了IRX1基因为瓢鸡无尾性状的功能基因，建立了简单、省时、低成本的快速有效PCR‑RFLP检测标记，为瓢鸡无尾基因的纯化及良种繁育体系的建立具有积极的指导意义。本发明的2个标记，可用于瓢鸡无尾性状的基因检测与分子标记辅助育种，具有早期筛选、快速鉴定、节省时间、成本低廉、准确性高等特点。

技术领域

本发明属于突变或遗传工程；遗传工程涉及的DNA或RNA，载体技术领域，尤其涉及一种瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：瓢鸡是中国“十一五”时期畜禽品种资源调查时发现中国特有珍稀鸡种，其产区为云南省普洱市镇沅县，相邻的宁洱县、景东县、景谷等县也有小量分布。瓢鸡因缺少尾部羽毛，包括尾羽和大小镰羽，形似瓢状，故称作“瓢鸡”，当地人也称其为“团鸡”。解剖发现，尾椎骨、尾棕骨、尾脂腺在瓢鸡均不存在。与正常鸡相比，瓢鸡臀部丰满圆润，肉多骨少，繁殖速度快，肉质香甜细腻，适应性强，早熟等特点，属于地方特色优质鸡类型。据镇沅县县志记载，1941年就有瓢鸡被饲养。由于瓢鸡尾羽和鸡翘的不足，长期以来被认为不祥，所以种群数量一直较小。2006年畜禽遗传资源调查时发觉仅存201只，濒临灭绝。瓢鸡基本采用农户散养，后经政府扶持和畜牧部门技术指导，建立瓢鸡保种场，瓢鸡种群数量逐年上升，2012年瓢鸡存栏已达102024只。因其独特的外貌特征和较高的经济价值，瓢鸡于2009年11月通过了国家家禽遗传资源委员会鉴定，并与2014年列入“国家级家禽遗失资源保护名录”且是云南省优先发展的6大名鸡之一。到目前为止，瓢鸡是国内首个发现和认定的无尾鸡品种，国际上，也仅有起源于智利现饲养在美国的阿劳干鸡(Araucana)有无尾性状。阿劳干鸡，源自于智利，现饲养在欧洲和美国等多个国度和地域，该鸡种以其无尾、簇状耳羽和蓝壳蛋而著称。阿劳干鸡臀部成圆形、无明显的尾部特征，由于没有相应的尾椎骨、尾综骨等骨骼支持，尾羽及尾脂腺也不复存在。外貌及剖解观察发现，还存在一类介于无尾和有尾之间的中间类型，可能受修饰基因影响。克莱姆森大学Clark博士研究团队2012年采用基因芯片全基因组关联方法定位了阿劳干无尾性状基因。该团队采用60K鸡基因组芯片，对40只无尾鸡、11只有尾鸡、7只中间类型鸡进行了全基因组基因分型，将无尾基因定位在鸡2号染色体88.77MB至89.51MB之间，该区间共有740kb，含有191个SNP，包括IRX1、IRX2两个候选基因。无尾基因(Rp)基因全基因组关联分析(GWAS)定位在鸡2号染色体87.99～90.13Mb区间内，共有2.14MB，检测到191个SNP；单倍型区间精细定位在88.78～89.51Mb区间，包括13个SNP，共有0.74MB。无尾基因Rp基因定位2号染色体的全基因关联显著Praw值为2.45×10^-10，单个染色体的显著Pgenome值为0.00575。IRX1和IRX2属于易洛魁(Iroquois)基因家族，该基因家族包含有2个基因簇，1个为A簇，含有IRX1，IRX2和IRX4三个基因，1个为B簇，包含IRX3，IRX5和IRX6三个基因。IRX家族在脊椎动物胚胎发育的早期起重要的作用，主要影响中枢神经系统和骨骼发育系统。基因表达模式揭示，同一族成员在胚胎发育过程中协调表达，共同参与了机体发育的同化和特化，IRX2还参与了神经板的分化。在非洲爪蟾胚胎研究中，IRX1通过抑制Bmp4的表达调控神经区域和背侧中胚层。IRX1和IRX2在果蝇和非洲爪蟾中已筛选出突变基因并鉴定了突变预模式。在基因功能研究方面，通过对小鼠和斑马鱼IRX基因敲除，发现IRX基因在其发育过程中具有抑制脊索和体节的形成，但对尾部发育影响不明显。对无尾瓢鸡和仙居鸡的雏鸡进行了解剖观察，结果显示瓢鸡雏鸡腰荐部椎骨数目与正常有尾鸡相比明显缺失，且该缺失变异在胚胎期形成，因此瓢鸡可作为椎骨发育研究的重要模式动物。由于瓢鸡资源发现较晚，数量和分布有限，目前对该鸡的基础研究相对较少。采用PCR产物直接测序技术对云南省镇沅县50只瓢鸡样品的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)高变区序列进行了分析，共检测到27个核苷酸多态位点，序列存在13种单倍型，表明瓢鸡群体内遗传变异较丰富，在遗传组成上具有5个母系血统来源。对无尾瓢鸡和仙居鸡的雏鸡进行了解剖观察，结果显示瓢鸡雏鸡腰荐部椎骨数目与正常有尾鸡相比明显缺失，且该缺失变异在胚胎期形成，因此瓢鸡可作为椎骨发育研究的重要模式动物。对无尾瓢鸡和仙居鸡进行了杂交，对F2代杂交鸡进行屠宰观察，对尾部骨骼进行X光成像分析，结果显示无尾性状的基因为显性及尾部形态结构。随着全基因组测序的完成，大量动物基因组测序工作延续开展，鸡基因组测序草图与注释也于2004年完成，使人们对鸡基因组有了初步认识。鸡基因组单倍体容量1.2×109DNA碱基对，有20000～23000个基因，分布在39对染色体上。2006年对该草图做了修订，补测了Z染色体及微小染色体的序列，填补了近800个基因组间隔(Gap)，注释了更多的基因信息如基因的结构和功能等内容。目前正在进行第3版的修订，预计不久将在NCBI公共信息平台公布(Build 3.0)，为研究者提供更为精确和详细的鸡基因组信息。与鸡基因组测序完成几乎同步，研究人员通过3个家鸡品种与红色原鸡序列的对比，构建了鸡基因组的遗传变异图谱，发现鸡基因组中含有280万个SNPs。基于鸡全基因组的遗传变异，全基因组的SNP基因芯片得以开发。美国Illumina公司2011年首次推出鸡60K SNP检测芯片(60K Illumina SNP BeadChip)，该芯片共有57636个SNPs^[60]。最近，Affymetrix公司又推出了鸡600K分型芯片(600KHD)，可检测SNPs的数量上升到580，954个，其中包括21，534个编码区变异。据该公司介绍，600HD高密度芯片将成为第一个商业化的鸡SNPs芯片，可用于基因组选择(GS)，基因组关联分析(GWAS)，选择特征分析(selection signatureanalyses)，QTL精细作图和拷贝数变异的检测等研究。GWAS的试验设计主要有两类：一类是单阶段设计(One-stage design)，另一类是两阶段设计(Two-stage design)。二者相比，两阶段是一种即经济又高效的研究策略。基因分型有对个体DNA直接分型和混合DNA池检测两种策略。后者是将具有表型差异分组的个体DNA混合在一起构成不同DNA池，检测两个DNA池间的基因频率差异，差异显著并相互连锁的标记被认为可能存在表型效应，该方法适于质量性状或高低极端表型明显的数量性状分析。GWAS分析一般只是鉴定出和目标性状相关的染色体片段，往往不是影响表型变异的主效基因或致因变异。因此，通过后续研究，如精细定位、位置克隆、表达谱分析、基因功能分析等，有利于揭示变异位点影响表型的作用机理，也可以直接应用于资源保护和育种工作。全基因组关联研究(GWAS)使用高通量的基因分型技术在基因组范围内搜索SNP，从整个基因组水平上检测SNP以及整体分析关联性，探讨其与表型以及复杂性状的关系，具有检测速度快、结果更加可靠等优点，成为目前人们研究的热点，在包括鸡在内的许多家养动物的QTL定位和QTN鉴别方面已取得一系列研究成果。美国爱荷华州立大学动物科学系Abasht和lamont(2007)首次使用3000个SNPs对2个鸡F2群体的腹脂率性状进行了GWAS分析，发现39个SNPs位点[19]。随后，在鸡体重、生长、免疫、繁殖等性状方面都陆续开展了全基因组关联分析。美国海兰蛋鸡公司Wolc等(2014)运用42KIllumina SNP芯片对褐壳产蛋母鸡连续8个世代13000只母鸡进行全基因组GWAS分析，记录的性状包括产蛋量、11个蛋品质指标和初产母鸡体重，采用Bayesian全基因组预测模型进行统计分析，结果显示，在鸡4号染色体78M处检测到1个大效应QTL，该QTL可解释32％的表型差异，另外，在鸡17，12，和2号染色体也检测到与产蛋量、蛋壳颜色及蛋白高度相关的QTL，表型差异解释率在5-7％之间。对北京油鸡和科宝肉鸡构建的F2资源群体，对93日龄鸡胫围和胫长的全基因组关联研究发现13号染色体上的NKX2-5基因可能影响胫长；4号染色体上LDB2、BOD1L1和QDPR等基因与胫围显著或潜在关联。利用Illumina 60K SNP Beadchip对724只北京油鸡的16个肉质性状开展全基因组关联分析，发现在4号染色体上存在7个显著SNPs，4个候选基因(LCORL，LAP3，LDB2，TAPT1)与胴体重和内脏重量相关，此外还预测了GJA1基因可能影响油鸡的胸肌发育。(2012)对鸡马立克病(Marek’s disease，MD)采用病例对照的方法进行了全基因组关联研究，在全基因组显著水平和极显著水平上分别检测到1个SNP，基因注释结果表明这两个位点分别落在SMOC1和PTPN3基因内。与对照组相比，SMOC1基因在病例组的脾脏中显著上调差异表达，由此推测该基因在MD中发挥重要作用。采用个体基因分型与DNA混合池分型相结合的GWAS分析是今后鉴定疾病和经济性状基因的一个重要趋势，该技术在不损失检测效应的同时可大大降低检测费用。(2013)对美国Virginia鸡生长性状双向选择50代以上的体重大和体重小的两个类群开展GWAS及生物信息学分析，结合个体与DNA混合池的60K SNP芯片分型技术，成功鉴定了10个与生长性状相关的主效基因(GCG，IGFBP2，GRB14，CRIM1，FGF16，VEGFR-2，ALG11，EDN1，SNX6，BIRC)。在鸡体型外貌等质量性状的基因定位和筛选方面，GWAS也大大提高了检测效率。(2012)通过连锁分析和全基因组关联研究发现鸡凤头性状的QTL位于E22C19W28连锁群上，且HOXC基因簇与其关联。通过对26个不同品种的凤头鸡和非凤头鸡的组织表达分析发现HOXC8在胚胎发育期颜骨皮肤中异位表达，由此推断凤头的产生是由H0XC8异位表达的顺式作用元件突变引起的。(2012)通过GWAS鉴定阿劳干鸡(Araucan chicken)无尾羽和耳絨毛性状的候选基因。其中鸡2号染色体2.14Mb的单倍型中两个易洛魁族(Iroquois)同源盒基因(homeobox genes)，IRXl和IRX2基因，在无尾羽阿劳干鸡具有一致的单倍型。具有耳绒毛性状的鸡共有一个0.58Mb的单倍型，包含7个基因，其中TBX1和GNB1L可能是该性状的重要候选基因。此外，GWAS分析已定位多个质量性状，如鸡的多趾、羽色、黑色素沉积、凤头等性状相关基因或QTL都已成功定位。值得一提的是，鸡600K Affymetrix Axiom HD genotyping array芯片开始用于GWAS分析，并已显示高分辨率优越性。最近，(2014)用600K SNP芯片定位id基因，在Z染色体78.5to79.2Mb区间内发现3个SNP与id基因紧密连锁。可以预见，600K Affymetrix Axiom HD高密度SNP芯片将在鸡基因组分析领域应用越来越广泛。瓢鸡是中国畜禽品种资源特有珍稀鸡种,其产区为云南省普洱市镇沅县，相邻的宁洱县、景东县、景谷等县也有小量分布。到目前为止，瓢鸡是国内首个发现和认定的无尾鸡品种。瓢鸡因缺少尾部羽毛，包括尾羽和大小镰羽，形似瓢状，故称作“瓢鸡”，当地人也称其为“团鸡”。解剖发现，尾椎骨、尾棕骨、尾脂腺在瓢鸡均不存在。与正常鸡相比，瓢鸡臀部丰满圆润，肉多骨少，繁殖速度快，肉质香甜细腻，适应性强，早熟等特点，属于地方特色优质鸡类型。由于瓢鸡尾羽和鸡翘的缺失，长期以来被认为不祥，所以种群数量一直较小。2006年畜禽遗传资源调查时发觉仅存201只，濒临灭绝。瓢鸡于2009年11月通过了国家家禽遗传资源委员会鉴定，并与2014年列入“国家级家禽遗失资源保护名录”且是云南省优先发展的6大名鸡之一。目前对该鸡的基础研究相对较少。贡潘偏抽等(2011)采用PCR产物直接测序技术对云南省镇沅县50只瓢鸡样品的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)高变区序列进行了分析，共检测到27个核苷酸多态位点，序列存在13种单倍型，表明瓢鸡群体内遗传变异较丰富，在遗传组成上具有5个母系血统来源。对无尾瓢鸡和仙居鸡的雏鸡进行了解剖观察，结果显示瓢鸡雏鸡腰荐部椎骨数目与正常有尾鸡相比明显缺失，且该缺失变异在胚胎期形成，因此瓢鸡可作为椎骨发育研究的重要模式动物。对无尾瓢鸡和仙居鸡进行了杂交，对F2代杂交鸡进行屠宰观察，对尾部骨骼进行X光成像分析，结果显示无尾性状的基因为显性及尾部形态结构。在瓢鸡羽色与肤色等色素性状研究方面，分析了黑色素受体(MC1R)基因、酪氨酸酶(TYR)基因与可溶性载质转运蛋白(SLC24A5)3个基因在瓢鸡不同羽色和肤色类群间的遗传差异，建立了MC1R基因TaqI、TYR基因HindIII和SLC24A5基因NheI 3个PCR-RFLP标记。在生长发育、屠宰性能和体尺测定方面，研究了类胰岛素生长因子受体1(IGFI)基因和线粒体DNA氧化酶基因(COX3)与上述性状的相关性。瓢鸡IGF1基因相对保守，没有检测到瓢鸡IGF1基因变异位点。在瓢鸡线粒体COX3基因检测到C10669T多态位点，建立了EcoRV PCR-RFLP分子标记，利用该标记对300日龄具有生长和屠宰性状记录的82只瓢鸡个体进行了基因分型，发现瓢鸡EcoRVPCR-RFLP标记与体重、龙骨长、屠体重与胸肌率4个性状相关显著。在瓢鸡疾病抵抗力方面，分离到瓢鸡特有肠炎沙门氏菌菌株，鉴定了鸡白痢易感群体和抗性群体，分析了杀菌蛋白基因(BPI)多态性与瓢鸡12项血液生理指标的相关分析，研究表明，瓢鸡BPI基因存在高度变异，在所测定的BPI基因3200bp序列中共检测到18个SNP位点，有4个SNP位点在沙门氏菌抗性群体和易感群体间基因频率存在显著差异。国际上，也仅有起源于智利现饲养在美国的阿劳干鸡(Araucana)有无尾性状，该鸡种以其无尾、簇状耳羽和蓝壳蛋而著称。阿劳干鸡臀部成圆形、无明显的尾部特征，由于没有相应的尾椎骨、尾综骨等骨骼支持，尾羽及尾脂腺也不复存在。外貌及剖解观察发现，还存在一类介于无尾和有尾之间的中间类型，可能受修饰基因影响。2012年采用基因芯片全基因组关联方法定位了阿劳干无尾性状基因。该团队采用60K鸡基因组芯片，对40只阿劳干无尾鸡、11只有尾鸡、7只中间类型鸡进行了全基因组基因分型，无尾基因(Rp)基因全基因组关联分析(GWAS)定位在鸡2号染色体87.991～90.13Mb区间内，共有2.14MB，检测到191个SNP；单倍型区间精细定位在88.78～89.51Mb区间，包括13个SNP,共有0.74MB。无尾基因Rp基因定位2号染色体的全基因关联显著Praw值为2.45×10-10，单个染色体的显著Pgenome值为0.00575。