[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法

说明书

一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于，包括：一、试剂；二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞；三、羊膜间充质干细胞传代培养。本发明与现有的羊膜间充质干细胞分离方法相比，使用两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞，第一步去除羊膜上皮细胞，且消化两次，使羊膜上皮细胞去除的更充分，获得的羊膜间充质干细胞纯度更高，并且操作简单，无需组织及细胞过滤，使用DNase Ⅰ避免羊膜间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离，获得的干细胞数量更多。整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。

技术领域

本发明涉及一种干细胞的分离、扩增方法，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，属于生物技术领域。

背景技术

间充质干细胞具有自我复制，多向分化和免疫调节的生物学特性，已经成为研究热点。骨髓来源的间充质干细胞研究虽多，但其采样势必通过创伤性获得，并且随着个体的成长，其质量和数量有所下降。目前，国内外研究人员已经能够从脐带，脐血，牙髓中获得间充质干细胞，但获得的细胞数量有限。寻求一种高效分离间充质的方法，且组织来源方便，不受伦理道德约束，是必然的发展趋势。胎盘组织作为再生医学最有价值的细胞来源，且不受伦理道德约束。羊膜比胎盘具有更丰富的间充质干细胞，已成为各研究者青睐的对象。

羊膜组织结构复杂，包括上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层及海绵层，而羊膜间充质干细胞位于羊膜的最内层。目前羊膜间充质干细胞的分离方法种类繁多，且或得的细胞纯度及活性结果不一。

本研究通过两步酶消化法，首先用胰蛋白酶和EDTA去除羊膜上皮干细胞，再用胶原酶Ⅰ和DNaseⅠ，消化分离获得羊膜间充质干细胞。

目前，分离羊膜间充质干细胞的方法主要是酶解法。羊膜组织结构复杂，单纯的酶解并不能将羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的分开，很难获得高纯度的间充质干细胞系；其次也有使用细胞刮刀去除羊膜上皮细胞后，再进行羊膜间充质干细胞的分离，这种方法容易造成污染，并且分离羊膜上皮细胞也不彻底；还有利用组织分离器，获得羊膜组织匀浆，再进行酶消化，操作相对繁琐，并且成本较高。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于，包括：

一、试剂

二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞

三、羊膜间充质干细胞传代培养。

进一步，一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，包括：

一、试剂

1.胎盘保存液及清洗液

注射用青霉素和硫酸链霉素用注射用生理盐水配置成每毫升1万单位的储存液，即为1％的双抗储存液；

500mL的注射用生理盐水加入5mL的双抗储存液，再加入2mL注射用硫酸庆大霉素，即配置成胎盘保存液或清洗液；

2.胰蛋白酶储存液

称取0.5g的胰蛋白酶，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.5％(m/v)的胰蛋白酶储存液；

3.EDTA储存液

称取0.2gEDTA二钠，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的EDTA储存液；

4.胶原酶Ⅰ储存液