[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法

权利要求书

1.一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于，包括：

一、试剂

二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞

三、羊膜间充质干细胞传代培养。

2.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于：其中，一、试剂包括：

1.胎盘保存液及清洗液；

2.胰蛋白酶储存液；

3.EDTA储存液；

4.胶原酶Ⅰ储存液；

5.DNaseⅠ储存液；

6.培养基及原代培养基。

3.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于：其中，二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞

1.胎盘运输；

2.羊膜分离组织分离；

3.羊膜上皮细胞分离；

4.羊膜间充质干细胞分离；

5.原代换液。

4.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于：其中，三、观察原代细胞融合度60％以上即可传P1代，接种密度为8000～10000个/cm²；以后细胞融合度达80％以上即可传代；传代为完全培养基，无需添加双抗或庆大霉素。

5.根据权利要求2 1所述的一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于：其中，一、试剂，包括：

1.胎盘保存液及清洗液

注射用青霉素和硫酸链霉素用注射用生理盐水配置成每毫升1万单位的储存液，即为1％的双抗储存液；

500mL的注射用生理盐水加入5mL的双抗储存液，再加入2mL注射用硫酸庆大霉素，即配置成胎盘保存液或清洗液；

2.胰蛋白酶储存液

称取0.5g的胰蛋白酶，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.5％(m/v)的胰蛋白酶储存液；

3.EDTA储存液

称取0.2gEDTA二钠，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的EDTA储存液；

4.胶原酶Ⅰ储存液

称取1g胶原酶Ⅰ，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为1％(m/v)的胶原酶Ⅰ储存液；

5.DNaseⅠ储存液

称取0.2g DNaseⅠ，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的DNaseⅠ储存液；

6.培养基及原代培养基

培养基为Lonza通用型无血清培养基，按使用说明添加血清替代品及L-谷氨酰胺；原代培养基每50mL添加1％的双抗储存液500μL，添加200μL的注射用硫酸庆大霉素。

6.根据权利要求3所述的一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于：其中，二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞，包括：

1.胎盘运输

孕妇分娩后的胎盘，置于含有保存液的胎盘储存盒中，2～8摄氏度及时运送回实验室；样本接收室检查运输温度，胎盘盒是否完整，避免出现污染，并对其进行编号；

2.羊膜分离组织分离

将胎盘置于不锈钢托盘中，用清洗液清洗1次；用手将围绕脐带周围胎盘子面的羊膜撕下，放入培养皿中，用手术剪将带有血渍的边缘剪掉，加入75％的医用酒精进行漂洗，再放入新的培养皿中，加入清洗液清洗，并用组织剪剪成1×1cm²大小的组织块，再用清洗液清洗一遍，转移至50mL离心管中，每管含羊膜组织10mL，1300rpm/min离心5min；

3.羊膜上皮细胞分离

离心结束后，弃上清，每管加入胰蛋白酶储存液3mL，EDTA储存液3mL，补充生理盐水至30mL，此时胰蛋白酶的浓度和EDTA的浓度分别为0.05％和0.02％；145rpm/min，37℃振荡消化15min；

消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清；再重复上述胰蛋白酶和EDTA消化的步骤；

4.羊膜间充质干细胞分离

上述消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清；将羊膜组织放入培养皿中，用清洗液清洗两次；

将羊膜组织放入新的50mL离心管中，每管约含组织10mL，并剪碎羊膜组织1-3mm；加入胶原酶Ⅰ2mL，DNAseⅠ2mL，补充生理盐水至20mL，此时胶原酶Ⅰ和DNAseⅠ的浓度分别为0.1％和0.02％；145rpm/min，37℃振荡消化60min；

消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清及组织；每管加入10mL原代培养基接种于10cm的培养皿中培养；

5.原代换液

培养至第3天，进行第一次半换液，第6天根据实际情况进行半换或全换液，以后每隔3天全换液。