[发明专利]高产L-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种高产L‑亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用，⑴将leuA突变基因整合至cgl1135假基因位点，leuA突变基因见序列1；⑵将ilvBN突变基因整合至cgl1890假基因位点，ilvBN突变基因件序列2；⑶P_{CP_2928}特异性启动子替换柠檬酸合酶原始启动子，P_{CP_2928}特异性启动子序列见序列3。采用本发明所提供的技术方案在摇瓶发酵30h可生产L‑亮氨酸32g/L，在5L发酵罐发酵50h左右可生产亮氨酸60g/L，最大生产强度可达1.5g/(L×h)，糖酸转化率为30％，是目前报道的发酵法生产L‑亮氨酸的最高水平。

技术领域

本发明涉及微生物领域、分子生物学领域，其中涉及L-亮氨酸和L-缬氨酸合成途径中的相关基因及其应用。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是一种放线菌目的革兰氏阳性菌，细胞呈短棒状八字排列。谷氨酸棒状杆菌在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。目前，包括L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬氨酸等大多数氨基酸都开始运用谷氨酸棒状杆菌发酵进行生产。

L-亮氨酸(L-leucine)与L-异亮氨酸(L-isoleucine)、L-缬氨酸 (L-valine)的分子结构中含有一个甲基侧链，而被称为支链氨基酸 (branched chain amino acids，BCAAs)。L-亮氨酸作为人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八种必需氨基酸之一，其应用领域正在逐渐扩大。目前，主要在医药、食品、化工、农药、化妆品、饮料业等领域取得了大规模的应用。亮氨酸具有十分重要的实用价值，市场对亮氨酸的需求量大，迫切需要成本低且能够大规模生产的亮氨酸生产工艺。

L-亮氨酸的生物合成途径所属的分支链氨基酸(L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸)合成途径，一直是科研人员研究的热点。L-亮氨酸可以通过蛋白质水解提取法和酶催化法获得，但由于提取工艺复杂，污染严重以及与异构体拆分困难等缺点，而通过微生物发酵法生产L- 亮氨酸，具有生长周期短、易控制、产率高、污染小等优点，是大规模工业化生产L-亮氨酸的理想方法。因此，目前生产L-亮氨酸的方法主要为微生物发酵法，使用的菌株以谷氨酸棒状杆菌为主。目前，L- 亮氨酸高产菌株的选育多采用诱变结合结构类似物抗性平板筛选的方法。Tsuchida通过诱变乳糖发酵短杆菌2256，选育出一株蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型突变菌株No.218(Met^-Ile^-2-TA^r)，能够积累L-亮氨酸 28g/L。但诱变育种选育L-亮氨酸产生菌的方法存在许多负向突变，并且遗传背景不清晰，导致对环境胁迫应对能力低，营养需求增高，生产易波动等问题，限制了菌株的工业化应用。

随着基因工程育种技术的不断发展，特别是基因编辑技术的改良大大提高了细胞工厂的构建效率，研究人员越来越青睐于对野生菌的染色体直接进行定向修饰从而获得各种生物制品的发酵菌株。张伟国等采用基因工程育种方法，优化改善C.glutamicum ATCC13032L-亮氨酸合成途径中的分支链转氨酶活性，L-亮氨酸积累量为18g/L。 Michael Vogt通过引入异丙基苹果酸合酶突变基因leuA，乙酰羟酸合酶突变基因ilvBN，同时敲除阻遏亮氨酸操纵子表达的LtbR及转录调控因子IolR。最终经50h分批补料发酵，可积累L-亮氨酸24g/L。虽然目前通过基因工程改造可获得谷棒杆菌亮氨酸产生菌，但是产酸水平较低，并且发酵产酸周期较长，生产效率较低，目前还达不到亮氨酸的工业化生产要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于发现并提供了L-亮氨酸合成途径中关键酶编码基因leuA突变基因序列、L-缬氨酸合成途径中关键酶编码突变基因ilvBN，该基因与谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032 相比，均存在多处碱基突变，并可有效解除L-亮氨酸和L-缬氨酸合成途径中存在的反馈效应。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：