[发明专利]农杆菌介导的甜椒遗传转化方法

说明书

本发明提供一种根癌农杆菌介导的甜椒遗传转化方法，所述方法至少包括以下步骤：提供甜椒外植体；提供含有目的基因的根癌农杆菌，侵染甜椒外植体；选择培养；生芽培养：生根培养。采用本方法或的甜椒遗传转化率高。

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的甜椒遗传转化方法。

背景技术

随着生命科学的蓬勃发展，分子生物学和基因工程也取得了长足的进步。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的外源基因转化方法，由于其可导入大片段DNA且导入基因拷贝数低，高转化率且表达效果好，引起了人们的极大关注，同时由于其对仪器和操作技术要求较低，被广泛应用植物基因工程中，用于研究未知基因功能，各种基因调控原件的机理等。目前，已知的80％的转基因植物是通过农杆菌介导完成的。

甜椒(学名：Capsicum annuum var.grossum)俗称灯笼椒、柿子椒、甜椒，中国台湾话也称作大筒仔，是茄科辣椒属辣椒的一个变种，分布于中国大陆的南北各地，属于“非人工引种栽培”类型植物。

利用农杆菌介导的甜椒转基因尚未有文献报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的甜椒遗传转化方法，用于填补现有技术中的空白。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种根癌农杆菌介导的甜椒遗传转化方法，所述方法至少包括以下步骤：

(1)提供甜椒外植体；

(2)提供含有目的基因的根癌农杆菌，侵染甜椒外植体3～7min，共培养36～72h，共培养时采用暗培养，培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为3～5mg·L^-1，α-萘乙酸的浓度为0.15～0.25mg·L^-1，乙酰丁香酮的浓度为小于200mmol/L；

(3)选择培养；培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为3～5mg·L^-1，α-萘乙酸的浓度为0.15～0.25mg·L^-1，卡那霉素(Kanamycin Kan)浓度为45～75mg·L^-1，头孢菌素的浓度为300～500mg·L^-1；

(4)生芽培养：培养基中卡那霉素(Kanamycin Kan)浓度为45～75mg·L^-1，6-苄氨基嘌呤的浓度为3～5mg·L^-1，α-萘乙酸的浓度为0.15～0.25mg·L^-1，浓度为300～500mg·L^-1头孢菌素的或者浓度为100～300mg·L^-1的特美汀；

(5)生根培养：培养基中α-萘乙酸的浓度为3～5mg·L^-1，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.15～0.25mg·L^-1，浓度为300～500mg·L^-1头孢菌素的或者浓度为100～300mg·L^-1的特美汀。

进一步地，所述甜椒外植体可以通过现有技术培养也可以通过市购获得。

利用现有技术培养甜椒外植体操作方法为：将甜椒种子侵泡、冲洗、消毒、在培养基上接种培养。培养条件可以是23～26℃，16h/d光照培养，6～12d后得到未长出子叶，带有子叶节的无菌苗。切去子叶节作为遗传转化的外植体。

根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens

特美汀为复方制剂，其组分为：替卡西林钠与克拉维酸钾。

进一步地，所述步骤(1)中甜椒外植体采用子叶节顶端的分生组织。

进一步地，所述方法中使用的全部培养基的pH为5.6～6.0。更优选为5.8。