[发明专利]基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法

说明书

本发明公开了一种基于液质联用技术分析蛋白‑多糖复合体消化率的方法。所述方法为：将蛋白溶液以及蛋白‑多糖复合体溶液在模拟胃液中体外消化；接着对消化后的蛋白以及蛋白‑多糖复合体变性处理、用超滤管去掉低分子量多肽碎片，截留在超滤管中的大片段多肽使用除胃蛋白酶之外第二种酶切位点明确的内切蛋白酶进一步完全水解，得到若干多肽片段；最后使用液相色谱‑质谱联用技术检测多肽的组成和丰度。根据第二种蛋白酶切和胃蛋白酶切肽段的多肽丰度，确定胃蛋白酶消化率。进一步根据两种肽段中蛋白‑多糖复合体组别中高丰度的多肽推断蛋白和多糖的结合位点。

技术领域

本发明属于分析方法技术领域，具体涉及一种基于液相色谱-质谱联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法。

背景技术

蛋白饮料类是我国国标GB/T 10789-2015饮料通则中规定的一大类饮料产品。是指以乳或乳制品，或其他动物来源的可食用蛋白，或含有一定蛋白含量的植物的果实、种子或种仁等为原料，添加或不添加其他事物原辅料和(或)食品添加剂，经加工活发酵制成的液体饮料。

蛋白饮料具有热量低、富含蛋白质等特点，近年来已成为大众关注的健康饮品，是新兴饮料市场的主角。以乳清蛋白饮料为例，因其有利于减脂、增肌受到了广泛的关注。蛋白类饮料制备过程中，尤其是在蛋白质浓度较高的情况下易产生沉淀的现象。其解决思路之一是加入可食用多糖，使其与蛋白形成可溶性复合体。以乳清蛋白饮料为例，食用菌多糖、卡拉胶、果胶以及壳聚糖等多糖与蛋白形成的可溶性复合体溶液中。

对于蛋白饮料来说，适当降低蛋白的消化速率有助于提高饱腹感和满足感，因此对于蛋白-多糖饮料的消化率的研究非常重要。目前该领域的研究并没有充分开展，少数的研究使用的分析方式较为单一，主要以体外模拟消化后结合SDS-PAGE电泳分析添加多糖对蛋白-多糖饮料的消化率的影响。采用的研究技术的局限性在于：1.SDS-PAGE的只能显示全部蛋白的消化速率的快慢，不能显示蛋白饮料中每一种蛋白质的消化速率；2.SDS-PAGE只能做到蛋白质的半定量，用于消化率的动力学研究则不够准确；3.无法提供蛋白-多糖结合位点等额外信息。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于液相色谱-质谱联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法。其主要操作思路为蛋白以及蛋白-多糖复合体在模拟胃液中体外消化；接着对消化后的蛋白以及蛋白-多糖复合体变性处理、用超滤管去掉低分子量多肽碎片，截留在超滤管中的大片段多肽使用除胃蛋白酶之外第二种酶切位点明确的内切蛋白酶水解；最后使用液相色谱-质谱联用技术结合生物信息学分析技术检测多肽的组成、序列和丰度；根据第二种蛋白酶切和胃蛋白酶切肽段的多肽丰度，确定胃蛋白酶消化率。

本发明中的技术可以实现：1.通过比较蛋白以及蛋白-多糖复合体的第二种蛋白酶水解多肽片段中两端均为第二种蛋白酶切肽段，两端分别为第二种蛋白酶切和胃蛋白酶切肽段的丰度，以确定胃蛋白酶消化率；2.通过上述两种肽段的序列，确定混合的蛋白溶液中不同蛋白的胃蛋白酶消化效率；3.上述两种肽段中蛋白-多糖复合体组别中高丰度的多肽推断蛋白和多糖的结合位点。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，该方法为：

步骤1，配制蛋白溶液和多糖溶液，将多糖溶液和蛋白溶液混合，调节pH值至2-6之间，得到蛋白-多糖复合体溶液；所述pH值为蛋白和多糖形成复合体的区域，蛋白和多糖种类不同时，对应的pH值会有不同。

步骤2，配制模拟胃液，对前述配制的蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液进行消化；

步骤3，经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂进行变性处理，然后采用除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶分别进一步水解所述蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，得到若干多肽片段；