[发明专利]基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法

权利要求书

1.一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，该方法为：

步骤1，配制蛋白溶液和多糖溶液，将多糖溶液和蛋白溶液混合，调节pH值至2-6之间，得到蛋白-多糖复合体溶液；

步骤2，配制模拟胃液，对前述配制的蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液进行消化；

步骤3，经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂进行变性处理，变性后的蛋白碎片使用膜孔径为3-15kDa的超滤管，离心过滤分级，保留截留在超滤管中的大片段多肽，向其中加入碳酸氢铵溶液，离心洗涤；所述离心洗涤处理后的大片段多肽，加入除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶进行水解，分别得到蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组的若干多肽片段；

步骤4，采用液相色谱-质谱联用分析前述水解后获得的若干多肽片段，根据蛋白数据库中乳清蛋白所包含的各种蛋白质的序列数据，获得所述多肽片段的质谱响应强度和序列信息；

步骤5，分别将蛋白-多糖复合体溶液组以及蛋白溶液组获得的多肽片段的质谱响应强度相除后取以2为底的对数作为定量数值，每组重复三次实验并进行双样本t检验，并将FDR0.05定为确定两组显著性差异的阈值；对每条多肽而言，若其定量数值大于等于1，同时p值小于0.05，则蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解肽段显著多于蛋白溶液组；若定量数值小于等于-1，同时p值小于0.05，则蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解肽段显著少于蛋白溶液组；若定量数值小于1且大于-1，则该肽段在不同组别无显著性差异。

2.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于：所述步骤1中，蛋白溶液中蛋白质与水的质量比为15％-25％，多糖溶液中多糖与水的质量比为2-5％。

3.如权利要求2所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于：所述多糖溶液和蛋白溶液以1:1体积比混合。

4.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述步骤2的具体过程为：

1)模拟胃液的配制：在水中添加HCl和胃蛋白酶，HCl的浓度为0.04-0.06M，胃蛋白酶的浓度为0.4-0.6μg/L，溶液体系的pH值为1.4-1.6；

2)含有模拟胃液的离心管置于恒温振荡器中，在35-38℃水浴，振荡5-10分钟，然后分别加入蛋白溶液、蛋白-多糖复合体溶液5-15毫升，在35-38℃水浴，振荡10-180分钟，用NaOH溶液调节反应液的pH至6-8，结束消化反应。

5.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述步骤3的具体过程为：

1)经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂，80-95℃加热4-6分钟，置于冰上冷却；

2)将变性后的蛋白碎片使用膜孔径为3-15kDa的超滤管，离心过滤分级，离心条件为3000-5000g，30-50分钟；保留截留在超滤管中的大片段多肽；

3)所述截留在超滤管中的大片段多肽，加入碳酸氢铵溶液，离心洗涤，离心条件为3000-5000g，30-50分钟，重复2-3次；

4)所述离心洗涤处理后的大片段多肽，加入除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶进行水解；多肽与蛋白酶的质量比为20-100:1，使用的蛋白酶水解缓冲液根据选用的蛋白酶类型确定，水解温度为25-45℃，水解时间为10-24小时。

6.如权利要求5所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述蛋白变性剂的配方选自以下其中之一：

1)6M盐酸胍,100mM三羟甲基氨基甲烷,10mM三(2-羧乙基)膦和40mM氯代乙酰胺；

2)8M尿素，150mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，50mM三羟甲基氨基甲烷，65mM二硫苏糖醇，1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1mM苯甲基磺酰氟。