[发明专利]一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法

权利要求书

1.一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

1）利用引物1，以ALV-J传染性克隆质粒为模板， PCR扩增出ALV-J传染性克隆线性化表达载体；所述引物1为：

ALV-J-linear-F：TAGGTTCCGAACGCGATGTAACGGGGCAAG；

ALV-J-linear-R：CTGCAAAGAGAGGGCTCGCCTCATCCTTC；

2）利用引物2，以ALV-K前病毒DNA为模板，PCR扩增出ALV-K囊膜蛋白基因；所述引物2为：

ALV-K-env-F： GCCCTCTCTTTGCAGGCATTTCTGACTGGATATCCTG；

ALV-K-env-R：CGCGTTCGGAACCTACACTGTTCCATTTTCGGGCTG；

3）利用重组酶ExnaseTM II对步骤1）和2）得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆转染DF-1细胞拯救出表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒；

所述步骤（1）与步骤（2）中的PCR扩增反应体系均为：模板2uL，5×Buffer 10uL，10mMdNTP Mix 1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL；

述步骤（1）与步骤（2）中的PCR扩增反应循环参数均为：95℃预变性4min；随后进行30个循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃ 延伸4min 30s/1min；72℃延伸10min；

所述步骤（1）与步骤（2）PCR扩增反应结束后，产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

2.根据权利要求1所述的一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法，其特征在于，所述具体重组反应体系如下：纯化的ALV-K env基因片段PCR产物50-100ng，纯化的ALV-J线性化载体170ng，2μL商品化的ExnaseTM Ⅱ酶，4uL 5×CE Ⅱ Buffer，其它补加水至20μL。