[发明专利]一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法

说明书

本发明公开了一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：制备破囊壶菌菌悬液；(2)在黑暗环境中，选择紫外光，取菌悬液均匀平铺在培养皿底部，加入灭菌后的磁子，搅拌，紫外照射，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释，均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，避光培养；(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落发酵培养，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。本发明的方法操作简单，成本低，且时间短。经过本发明的方法获得的菌株，较野生株DHA产量提高最多可达32％，经济效益显著。

技术领域

本发明属于工业发酵生产用产二十二碳六烯酸(DHA)的高产菌株的选育，特别涉及的一种海洋破囊壶菌进行紫外诱变进行选育，从而获得高产菌株的方法。

背景技术

二十二碳六烯酸(DHA)俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，因其含有6个不饱和烯键的特有结构，使它具有独特的生理功能和经济价值，对人类健康有着特殊的作用和影响，但人体和动物不能合成，因此必须从食物中获取足够的DHA，并且随着生活水平的提高，人们也越来越重视DHA的补充。

破囊壶菌(Thraustochytrids)是一类异养的专性海生真菌类原生生物，近年来由于其富含多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，尤其是二十二碳六烯酸(Docosahexanoic acid，DHA)而备受关注。

在微生物菌种选育过程中，诱变育种是主要方法之一。利用简便高效的诱变方法处理微生物，使其在非自然条件下大幅度提高随机突变频率，然后从中挑选符合要求的高产突变株。提高DHA的产量势在必行，而在众多技术中，优良菌株的选育工作是其中的重要组成部分，一个高产菌株可以直接提高发酵效率，带来巨大的经济效益。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的存在的所诱变的菌株DHA产量较低的不足，提供一种操作简单、高效廉价的高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：

(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在10⁷～10⁹CFU/mL的菌悬液；

(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热25-35min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液15-20mL均匀平铺在培养皿底部，加入2-3粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射10-20s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取50-100μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在15-30℃恒温培养箱中避光培养24-48h；

(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在15-30℃、150-200r/min培养3-5d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。

本发明的优点：

本发明的方法操作程序简单，成本低，且时间短，突变效果明显，易于推广。

经过本发明的方法获得的菌株，较野生株DHA产量提高最多可达32％，经济效益显著。

附图说明

图1是野生株和突变株的生物量及DHA产量对比图。

图2是突变株的稳定性考察。