[发明专利]一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法

权利要求书

1.一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)原料预处理：取水牛睾丸消毒后在超净台中剪去白膜，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；

(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入一级消化液置于培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；

(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液；

(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化2～5min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液；

(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述水牛睾丸为3～7个月龄水牛睾丸，所述消毒为通过75％的酒精进行浸泡消毒5～15min，所述清洗是使用含双抗的PBS重复清洗三次。

3.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述一级消化液为质量比1～3％的胶原酶和质量比0.001～0.005％的DNase I酶，所述消化时间为5～15min，所述培养箱为二氧化碳培养箱，培养箱的培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度。

4.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：所述离心为在50ml离心管中以1500～2500rpm的转速水平离心5～10min。

5.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述PBS的添加量为10～16ml。

6.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述二级消化液为0.1～0.4％的trypsin-EDTA和0.003～0.007％的DNase I酶，所述血清为胎牛血清FBS和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。

7.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述培养液包括以下体积份数的原料：78～88份IMDM基础培养液、6～13份血清替代物KSR、0.1～0.3份胎球蛋白Fetuin、0.01～0.03份非必需氨基酸NEAA、0.01～0.03份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.01～0.06份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.01～0.05ng/ml GDNF、0.05～0.2ug/ml GFRα1、0.01～0.07ng/ml bFGF、0.01～0.07U/ml Lif和10^-5～10^-3nM/Lβ-ME。

8.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述过滤为选用若干个不同孔径的细胞网，依次使用孔径由大到小的细胞网进行过滤。

9.根据权利要求8所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：所述细胞网有两种孔径，分别为70μm和40μm。