[发明专利]连续应用亲和层析和陶瓷羟基磷灰石层析分离抗体药物的方法

说明书

本发明公开一种连续应用亲和层析和陶瓷羟基磷灰石层析分离抗体药物的方法，包括步骤：1)向经过亲和层析纯化之后的抗体溶液中加入磷酸钠缓冲盐至终浓度为5‑15mM，用Tris‑base调节抗体溶液的pH为6.7～6.9，用NaCl调节抗体溶液的电导率为5～7mS/cm；2)将步骤1)得到的抗体溶液采用陶瓷羟基磷灰石层析；陶瓷羟基磷灰石层析的步骤为：a、处理亲和填料，上样；b、使用淋洗2缓冲液淋洗柱层析；淋洗2缓冲液为体积分数10％的Buffer‑B；c、洗脱，先使用Buffer‑B梯度洗脱，再使用100％Buffer‑B洗脱。本发明的方法，可以连用亲和层析，进行两步纯化，简化了蛋白的纯化流程，降低了成本，极大的缩短时间；还具有分辨率高的特点，可将蛋白的纯度提高到90％以上。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，也别是涉及一种抗体药物的分离与提纯的方法。

背景技术

在抗体药物研发过程中，抗体的分离与纯化是关键步骤。在抗体制备过程中，首先进行富集蛋白，例如Protein A和Protein G亲和纯化。这一过程中，需要低PH值进行洗脱。在低PH下，蛋白质容易产生多聚，特别是对于双特异性抗体。因此，寻求快速有效的分离方式以降低抗体中的多聚体对于抗体生产具有非常重要的意义。

羟基磷灰石，是自然界广泛存在的一种钙磷酸盐无机化合物，分子式为(Ca₅(PO₄)₃(OH))₂。天然的羟基磷灰石能够与蛋白质，多肽和核酸等相互作用，可以作为蛋白质层析柱的填充介质。但是，天然羟基磷灰石稳定性较差，使用寿命较短。1986年kadoya等将煅烧法引入，研制出陶瓷羟磷灰石，并开始作为层析柱介质使用。

尽管陶瓷羟磷灰石有以上一些优势，但是它在某种程度上并非是一种简洁的层析填充材料，相比单模相互作用的层析材料而言，有关它的研发相对较困难。因此，关于CHT陶瓷羟磷灰石层析柱与亲和层析结合用于分离抗体药物，并没有被大部分研究者应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种分离抗体药物的方法，能够快速有效的去除抗体中的多聚体，得到多聚体明显降低的抗体药物，且极大的缩短了纯化时间。

为解决上述技术问题，本发明提供一种连续应用亲和层析和陶瓷羟基磷灰石层析分离抗体药物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)向经过亲和层析纯化之后的抗体溶液中加入磷酸钠缓冲盐至终浓度为5-15mM，用Tris-base调节抗体溶液的pH为6.7～6.9，用NaCl调节抗体溶液的电导率为5～7mS/cm；

2)将步骤1)得到的抗体溶液采用陶瓷羟基磷灰石层析。所述陶瓷羟基磷灰石层析的步骤为：

a、处理亲和填料，上样；

b、淋洗，使用淋洗2缓冲液淋洗柱层析；所述淋洗2缓冲液为体积分数10％Buffer-B+90％Buffer-A；所述Buffer-B为10mM磷酸钠缓冲盐、1M氯化钠、pH 6.8的溶液；所述Buffer-A为10mM磷酸钠缓冲盐、30mM氯化钠、pH 6.8的溶液；

c、洗脱，先使用Buffer-B+Buffer-A的溶剂体系进行梯度洗脱，Buffer-B体积分数由10％梯度升高至90％，Buffer-A体积分数由90％梯度降低至10％；再使用100％Buffer-B洗脱，收集产品。

在本发明的实施例中，步骤1)中，所述亲和层析纯化包括protein A亲和层析和protein G亲和；优选的，所述亲和层析纯化是指将抗体药物经过protein A亲和层析和protein G亲和层析进行纯化。

在本发明的实施例中，步骤1)中，磷酸钠缓冲盐终浓度为8-12mM；作为优选，磷酸钠缓冲盐终浓度为10mM。