[发明专利]连续应用亲和层析和陶瓷羟基磷灰石层析分离抗体药物的方法

权利要求书

1.一种连续应用亲和层析和陶瓷羟基磷灰石层析分离抗体药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)向经过亲和层析纯化之后的抗体溶液中加入磷酸钠缓冲盐至终浓度为5-15mM，用Tris-base调节抗体溶液的pH为6.7～6.9，用NaCl调节抗体溶液的电导率为5～7mS/cm；

2)将步骤1)得到的抗体溶液采用陶瓷羟基磷灰石层析；所述陶瓷羟基磷灰石层析的步骤为：

a、处理亲和填料，上样；

b、淋洗，使用淋洗2缓冲液淋洗柱层析；所述淋洗2缓冲液为体积分数10％的Buffer-B+90％Buffer-A；所述Buffer-B为10mM磷酸钠缓冲盐、1M氯化钠、pH 6.8的溶液；所述Buffer-A为10mM磷酸钠缓冲盐、30mM氯化钠、pH 6.8的溶液；

c、洗脱，先使用Buffer-B+Buffer-A的溶剂体系进行梯度洗脱，Buffer-B体积分数由10％梯度升高至90％，Buffer-A体积分数由90％梯度降低至10％；再使用100％Buffer-B洗脱，收集产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述亲和层析纯化包括protein A亲和层析和protein G亲和。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述亲和层析纯化是指将抗体药物经过protein A亲和层析和protein G亲和层析进行纯化。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述磷酸钠缓冲盐终浓度为8-12mM；优选的，磷酸钠缓冲盐终浓度为10mM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，用Tris-base调节抗体溶液的pH至6.8。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，用NaCl调节抗体溶液的电导率至6mS/cm。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，陶瓷羟基磷灰石层析使用球形陶瓷羟磷灰石填料，所述填料具有两个结合位点，其中一个结合位点为五个钙双联体，另一个结合位点为一对含有羟基的磷三联体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤a中，处理亲和填料包括淋洗、预处理和平衡三个操作；淋洗是使用ddH2O溶液淋洗柱层析；预处理是使用pH 6.8、500mM的磷酸钠缓冲盐溶液处理柱层析；平衡是使用Buffer-A，所述Buffer-A为10mM磷酸钠缓冲盐、30mM氯化钠、pH 6.8的溶液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，Buffer-A用量为5-15倍柱体积；优选的，Buffer-A用量为10倍柱体积。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤b中，淋洗2缓冲液用量为2-10倍柱体积；优选的，淋洗2缓冲液用量为5倍柱体积。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤c中，梯度洗脱溶剂用量为10-30倍柱体积；优选的，梯度洗脱溶剂用量为20倍柱体积。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤c之后还设有步骤d：对层析柱进行平衡和保存。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤d中，先用Buffer C清洗柱层析中的残留蛋白，再用Buffer D储存层析柱，所述Buffer C为pH 6.8、500mM磷酸钠缓冲液，所述Buffer D为500mM NaOH溶液。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，Buffer C用量为2-10倍柱体积，优选为5倍柱体积；Buffer D用量为1-3倍柱体积，优选为2倍柱体积。

15.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)在20～30摄氏度下进行。