[发明专利]自断蛋白的活性控制及其应用

说明书

本发明提供一种在无酵素参与下，具自断能力的自断蛋白，以及如何控制该自断蛋白来生产目标蛋白的方法。自断蛋白主体为一内含蛋白，所述内含蛋白的N端氨基酸包含至少有一突变，本发明的自断蛋白在“抑制条件”下，自断蛋白不会产生自我断裂，在“促进条件”下，自断蛋白的C‑端会产生自我断裂，而N‑端则不会产生自我断裂。本发明另提供一种含有该自断蛋白及目标蛋白的融合蛋白。

【技术领域】

本发明是有关于一种自断蛋白，包含此自断蛋白的融合蛋白，以及控制自断蛋白生产目标蛋白的方法。

【先前技术】

内含蛋白是一种天然存在的自我剪接蛋白结构域，功能为从较大的蛋白质结构中自我切除，同时将两侧的胜肽“外显子(exteins)”连接在一起形成成熟的宿主蛋白。

内含蛋白因可重新排列两侧的键结，造就出许多使用内含蛋白的生物技术。这些技术包括各种类型的蛋白质连接、活化，以及蛋白质标记和追踪应用。内含蛋白还有一个重要应用是生产、纯化重组蛋白。特别是，内含蛋白具有自我切除的能力，因此可为研究、医疗及其他商业上应用做出重大的应用。

传统的标签序列为纯化目标蛋白提供了简单而有力的方式，可利用简单的基因重组技术与目标蛋白融合。这些标签已广泛地使用于现在的研究中，并且成为研发与制造的主要平台。然而，虽然目标蛋白可在适当的宿主细胞中表现，并利用标签序列纯化，但标签序列的存在可能会降低目标蛋白的活性，并可能产生不需要的免疫原性。因此，在纯化后将亲和性标签去除是非常重要的，一般是利用高特异性的内切酶进行切除。虽然这些酵素通常有效，但是酵素过于昂贵，对于量产不利，且需要额外的步骤来去除这些酵素。

因此，内含蛋白提供一般标签自我切割的能力是一项重大进步，已有一些文献揭示使用内含蛋白的自我切割能力来移除亲和性标签序列的系统。然而，此方法仍然存在一些重大缺点，以阻碍内含蛋白的应用。例如，在蛋白质表现及纯化的过程必须确实抑制内含蛋白的自我切割反应，但一旦要纯化目标蛋白，则需要控制反应能快速完成；在常见的内含蛋白中，经常需要额外添加硫醇化合物(如，二硫苏糖醇)来诱发断裂，增加成本及事后移除的程序。

因此，业界需要一种稳定、不需额外填加酵素或硫醇化合物、低成本的蛋白质纯化的方法。

【发明内容】

有鉴于此，本发明提供一种自断蛋白、包含此自断蛋白的融合蛋白，以及利用此自断蛋白生产目标蛋白的方法。

本发明提供一种自断蛋白，包括内含蛋白，其中所述的内含蛋白的N-端氨基酸至少包含一个突变，移除N-端自我断裂活性，只保留C-端自我断裂活性，通过调控盐浓度、pH值和温度控制自断蛋白的活性。

在本发明实施例中，所述内含蛋白的N端突变，氨基酸经置换、删除、插入及/或取代。

在本发明实施例中，所述内含蛋白源自于Npu DnaE。

在本发明实施例中，所述内含蛋白N端第1个氨基酸由半胱氨酸(Cys)置换为甘氨酸(Gly)或丙氨酸(Ala)。

在本发明实施例中，所述自断蛋白的序列由下列族群组成:SEQ ID NO:1或/和SEQID NO:2。

在本发明实施例中，所述自断蛋白的序列为:

GLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN

在本发明实施例中，所述自断蛋白的序列为: