[发明专利]CEA与dbpA双标记结直肠癌检测试剂的制备方法及使用方法

说明书

本发明属于结直肠癌早期检测领域，具体涉及CEA与dbpA双标记结直肠癌检测试剂的制备方法及使用方法。包括以下步骤：1)用缓冲液稀释CEA‑BSA和dbpA‑BSA的包被原，加入到96孔板中，过夜，弃包被液，加入封闭液，封闭，弃掉封闭液，洗涤，真空抽干，冷冻保存；2)将步骤1)中产物加入带有滤膜的离心管中离心，再用缓冲液重复洗涤多次，与标记试剂充分混匀，振荡过夜；3)将步骤2)中产物分离纯化，用洗脱液洗脱，同时收集流出液，逐管测量吸光度，测定蛋白含量，根据所述标记试剂的说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。本技术方案以双抗夹心法，建立同时检测CEA和dbpA的双标记时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)法，为结直肠癌快速准确检测提供新的理念和方法。

技术领域

本发明属于结直肠癌早期检测领域，具体涉及CEA与dbpA双标记结直肠癌检测试剂的制备方法及使用方法。

背景技术

结直肠癌已成为全世界范围内导致肿瘤病人死亡的重要病因。尽管大量的药物治疗，手术治疗及化学疗法已获得很大程度改善，由于其致病因素的复制性，对结直肠癌最佳的治疗手段还充满了争议。近几年来，一些靶向分子治疗成为了研究开发治疗结直肠癌的热点。然而，由于结直肠癌异质性的特点，使得寻找新的检测指标及靶向治疗分子显得尤为重要。

在结直肠癌分子检测领域目前常见的肿瘤标志物是癌胚抗原CEA、糖类抗原CA19-9、CA242等，它们均是广谱肿瘤标志物，仍然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，而在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面，仍有重要临床价值。所以开发更为特异、敏感、简便的结直肠癌早期诊断和筛查标志物，成为了结直肠癌诊治中具有重要价值和亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是：提供CEA与dbpA双标记结直肠癌检测试剂的制备方法及使用方法，用以克服上述现有技术中的缺陷。

本发明所采用的技术解决方案是：

CEA与dbpA双标记结直肠癌检测试剂的制备方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：

1)用缓冲液稀释CEA-BSA和dbpA-BSA的包被原，加入到96孔板中，过夜，弃包被液，加入封闭液，封闭，弃掉封闭液，洗涤，真空抽干，冷冻保存；

2)将步骤1)中产物加入带有滤膜的离心管中离心，再用缓冲液重复洗涤多次，与标记试剂充分混匀，振荡过夜；

3)将步骤2)中产物分离纯化，用洗脱液洗脱，同时收集流出液，逐管测量吸光度，测定蛋白含量，根据所述标记试剂的说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。

进一步的，步骤1)具体过程为：

用50mmol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液将CEA-BSA和dbpA-BSA的包被原稀释成2μg/mL，100μL/孔同时加入到96孔板中，4℃过夜，弃包被液，加入封闭液，37℃封闭2h，弃掉封闭液，洗涤，真空抽干冷冻并于–20℃保存。

进一步的，步骤2)具体过程为：

将0.5mg步骤1)中产物加入Millipore的带有滤膜的离心管中，8000r/min离心8min，再用50mmol/L，Na2CO3，pH9.0的标记缓冲液重复洗涤6次，将200μL标记抗体和50μgEu³⁺和Sm³⁺标记试剂充分混匀，25℃振荡过夜。

进一步的，步骤3)具体过程为：

标记完成后用SephadexG-50层析柱分离纯化，用含0.9％NaCl的50mmol/L的Tris-HCl洗脱液洗脱，同时收集流出液，1mL/管，逐管测量吸光度A280，测定蛋白含量，根据Eu³⁺和Sm³⁺标记试剂盒说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。