[发明专利]“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种“人源性”致心律失常性右室心肌病(ARVC)疾病模型的建立方法。该方法是将ARVC患者皮肤进行原代培养获得成纤维细胞，通过非整合性仙台病毒诱导获得ARVC病人特异性诱导多能干细胞(iPSC)，再将其定向分化为ARVC病人特异性的心肌细胞，以建立一个稳定的体外心肌细胞疾病模型。本发明可基于iPSC技术建立稳定的人源性ARVC模型，形态与功能均符合ARVC病理特征，该模型适合用于ARVC相关病理机制研究以及个体化药物筛选。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，公开了一种“人源性”致心律失常性右室心肌病(ARVC)疾病模型的建立方法，可用于ARVC的相关病理机制研究及其治疗和预防药物的研发。

背景技术

致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenic right ventricularcardiomyopathy，ARVC)是一种心肌病，多见于青壮年男性，男女比例约为2.7:1。该病病理特征为右心室内的心肌萎缩和纤维脂肪组织替代，临床常表现为右心室扩大、心律失常、猝死和心力衰竭，是运动性猝死中的常见死因。30％～50％的ARVC病例具有家族性，主要表现为常染色体显性遗传，外显率不一。目前已知至少9个ARVC相关基因，其中多数为编码桥粒蛋白的基因。迄今为止，关于ARVC疾病发生的分子机制研究并不清楚，且存在很大争议，主要为基于小鼠疾病模型的研究。然而，小鼠与人类在各种生理系统上存在很大差异(例如人心肌细胞的搏动频率是60次/分，而小鼠的搏动频率是400-600次/分)，很多研究结果不能直接应用于人类疾病。因此，如何建立一个“人源性”心肌细胞模型对于ARVC等心血管疾病的研究十分重要。

人诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cells，hiPSCs)的出现为转化医学和再生医学提供了强大的动力和革命性的模式转变，拉近了干细胞用于临床疾病治疗的距离。hiPSCs广泛地应用于心血管疾病的研究中，在疾病模型建立、疾病分子机制研究以及新药研发等方面具有巨大的潜在价值。与人成体干细胞相比，hiPSCs的一个明显优势在于它的多能性，而正是这种多能性，赋予了它可以分化成为人体内任意一种细胞的能力，如心肌细胞、血管细胞、神经细胞、肝脏细胞等。对于心血管疾病研究而言，人原代心肌细胞是最理想的细胞资源，然而很难获取，且体外培养条件苛刻，因此其应用受到很大限制。应用心肌定向分化技术，可以将hiPSCs分化成为心肌细胞，这些hiPSC衍生的心肌细胞(hiPSC-CMs)携带人类基因组、具有“人源性”生理内环境、获取相对容易并可体外长期培养，是目前已知的与人原代心肌细胞最为相似的细胞资源。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了“人源性”致心律失常性右室心肌病疾(ARVC)病模型的建立方法。

“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法包括如下步骤：

1)原代培养获得成纤维细胞

将ARVC患者皮肤组织块儿用PBS+1％青链霉素润洗，吸走PBS，加入胶原酶于37℃消化6小时。随后加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，置于培养箱培养，等待皮肤组织贴壁，每隔4天换液。当培养皿中成纤维细胞长满后获得P₀代成纤维细胞，冻存保种并传代扩增培养。

其中所述的PBS为磷酸盐平衡生理盐水，DMEM是本领域熟知的一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，PBS+1％青链霉素及DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基中的百分比均按体积比计算。

2)ARVC病人特异性iPS细胞株的建立

将成纤维细胞种入孔板中，选择1孔刚好长满的细胞进行仙台病毒感染，24小时后换成DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，每隔1天换液，第7天将细胞传入预先铺有Matrigel的培养皿中，同时培养基改为mTeSR。