[发明专利]长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用

说明书

本发明提供了长链非编码RNA‑NKILA在骨组织损伤修复中应用。实验证明，过表达NKILA能够显著促进间充质干细胞中的钙离子沉积，显著增强间充质干细胞中的碱性磷酸酶活性，并能显著提高间充质干细胞中成骨分化标志物RUNX2、SP7、SPP1基因的表达量。

技术领域

本发明属于干细胞生物工程技术领域，更具体的说，涉及长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用。

背景技术

骨骼损伤修复和再生，一直以来都是医学界的一大难题。对于运动性的骨骼损伤，医学界常常采用自体骨移植、同种异体骨移植、带血供的游离骨移植以及生物材料替代等传统方法进行治疗，但这些方法存在来源少、并发症多、免疫排斥以及医源性感染等诸多问题，治疗效果并理想。随着骨组织工程技术的不断发展，人们逐渐开始运用组织工程的方法，来解决骨组织损伤修复的问题。间充质干细胞作为一类具有良好增值能力以及多向分化潜能的种子细胞，走进了人们的视野。研究发现，间充质干细胞可以从骨髓、脂肪等多种组织中分离获取；在特定的条件下，间充质干细胞还可以分化成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种细胞；此外，间充质干细胞还具有很低的免疫原性。这些特有的特性使得间充质干细胞成为了临床上骨组织损伤修复和再生的种子细胞。大量研究证据表明：间充质干细胞的成骨分化，在分子水平上受到多种调控因子的影响，其中包括一些重要的转录调控因子，例如RUNX2和SP7等，它们能够通过调节成骨分化相关基因的表达来调控干细胞的成骨分化，此外，还有很多非编码RNA也参与了干细胞成骨分化的调控作用。

长链非编码RNA是一类非编码蛋白并且长度一般来说大于200个核苷酸的小分子RNA，其表达量往往偏低并且具有组织特异性。由于长链非编码RNA的低表达量，人们往往忽略了这类RNA分子在生物学功能上的重要性。近年来，由于高通量测序技术的发展和应用，人们发现长链非编码RNA在细胞凋亡、增殖、分化等多种生物学过程中都具有非常重要的调控功能。例如，近来人们发现了一个长链非编码RNA，称为PU.1-AS，它可以通过阻断PU.1基因的表达，从而促进间充质干细胞的成脂分化。再如另一个长链非编码RNA，称为ANCR，它可以通过调节RUNX2基因的表达，来调控间充质干细胞的成骨分化。这些研究表明，长链非编码RNA在干细胞向特定的细胞方向分化的过程中有着重要的调控作用。因此，通过改变细胞中某些重要的长链非编码RNA的表达量，能够达到诱导干细胞向特定方向分化的目的，从而为组织损伤修复等医学难题找到新的解决方案。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用。

本发明的另一个目的在于，提供长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复检测中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用，所述长链非编码RNA-NKILA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

一种用于骨组织损伤修复的过表达载体pLV-NKILA，其由NKILA基因片段与慢病毒空载体pLV构建而成；所述NKILA基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述慢病毒空载体pLV的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

所述过表达载体pLV-NKILA的构建方法，包括以下步骤：采用限制性内切酶BamH I和Xba I分别对慢病毒载体pLV以及NKILA基因片段进行双酶切，并采用T4DNA连接酶体系对酶切后的NKILA基因片段及线性慢病毒载体pLV进行连接反应，然后转化感受态细胞，筛选阳性菌落，提取阳性菌落的质粒，得到所述的过表达载体pLV-NKILA。

进一步地，所述NKILA基因片段的制备方法，包括以下步骤：依据所述长链非编码RNA-NKILA的核苷酸序列，采用DNA合成仪，根据固相亚磷酰胺三酯法原理对NKILA基因片段进行双链合成，同时在其5’末端和3’末端上分别添加BamH I和Xba I酶切位点，得到含有特异性酶切位点的NKILA基因片段。