[发明专利]一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法

说明书

本发明公开了大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：（1）培养基的配制；（2）接种；（3）菌体培养。本发明提供了一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，在保持较高的单位菌体质粒含量的基础上，能显著提高大肠杆菌的纯度，不需要进行菌体的纯化培养，简化了大肠杆菌的培养过程，提高了质粒DNA的纯度和含量，具有很好的市场推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法。

背景技术

质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞（如大肠杆菌）中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。细菌的培养作为生产质粒 DNA 的第一步，在整个生产过程中起着关键的作用。它兴驻直接影响到质粒 DNA 的产量，而且也影响下续步骤的进行。因此，选择和优化菌体的生长条件，是产生大量稳定的质粒 DNA必要条件，特别是培养基的组成成分和浓度对细菌的生长和质粒DNA 的含量有较大的影响。

现有的运用于质粒DNA工程菌高密度表达的培养基虽然可以达到较高的菌体密度和质粒总量的目标，但质粒DNA比含量普遍较低，利用现有的培养基配方，虽然质粒DNA含量有了一定程度的提高，但结果仍不令人满意。而且现有的大肠杆菌的培养方法，首先需要对菌液进行纯化处理，再进行扩大培养，质粒提取完成后，需要花费大量的人力和物力去进行纯化，造成资源的极大浪费，而且所提取的质粒DNA的质量却不尽人意。因此，急需要开发一种适用于大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，在保持较高的单位菌体质粒含量的基础上，能显著提高大肠杆菌的纯度，不需要进行菌体的纯化培养，简化了大肠杆菌的培养过程，提高了质粒DNA的纯度和含量，具有很好的市场推广应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：

（1）培养基的配制：

a. 称取相应重量份的牛肉膏2.5~3.5份、蛋白胨10.5~11.5份、氯化钠2.2~2.8份、改性碳酸镧3.2~3.8份、活性炭1.2~1.8份、酒石酸0.32~0.38份、柠檬酸0.12~0.18份、甘油12.5~13.5份、去离子水820~880份备用；

b. 将操作a中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为97~99℃，持续搅拌32~38min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；

c. 等到操作b中所得溶液内的温度降至42~48℃时，用1.2~1.8mol/L的盐酸溶液或1.2~1.8mol/L的氢氧化钠溶液将操作b中所得的溶液的pH调至7.4~7.6；

（2）接种：

取100~120μL氨苄青霉素投入200~300mL步骤（1）所配制的培养基中，然后取100~120μL大肠杆菌DH5α菌株接种到添加有氨苄青霉素的培养基中，再称取特制的复合粉投入含有菌株和氨苄青霉素的培养基中；

（3）菌体培养：

将步骤（2）中的培养基置于恒温摇床上进行菌株培养，在培养的同时进行声光波交替联合处理，摇菌培养直到菌液的OD600达到0.9~1即可。

进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改性碳酸镧的制备方法包括如下步骤：