[发明专利]一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，首先制备PBMCs，然后在体外对γδT细胞进行扩增，接着加入CAR病毒和polybrene进行感染，本发明方法中根据γδT细胞纯度，来确定制备CAR‑γδT细胞时间，不需要额外进行细胞纯化，简化了操作流程，降低了成本，本发明方法操作简单、成本低，制备的CAR‑γδT细胞具有特异性肿瘤杀伤作用，并可产业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因工程改造的嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法。

背景技术

T细胞根据细胞表面T细胞受体(T cell receptor，TCR)分子结构的不同可以分为αβT细胞和γδT细胞。αβT细胞是适应性免疫细胞，对抗原的识别受主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)的限制，且需要抗原提呈细胞(Antigenpresenting cell，APC)的参与。由于肿瘤细胞往往存在MHC类分子丢失，因此αβT细胞无法有效清除肿瘤细胞，这大大降低了以αβT细胞为主导的抗肿瘤细胞免疫。利用基因工程技术对αβT细胞进行改造，使其表达嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，从而制备出不受MHC和APC限制的αβT细胞，即CAR-T细胞技术。CAR-T细胞技术已经在血液系统肿瘤中取得了巨大的突破，以CD19为靶点的CAR-T细胞已于2017年被美国FDA批准用于治疗儿童和年轻成年急性淋巴细胞性白血病患者。

γδT细胞虽然也是T细胞，但是却是固有免疫细胞，对抗原的识别不受MHC限制，也不需要APC的提呈。虽然γδT细胞在外周血T淋巴细胞中的比例仅为5％左右，但它却广泛参与过敏、感染、自身免疫病和肿瘤等疾病过程，是人体免疫系统第一道防线的重要组成部分。临床研究表明过继γδT细胞输注能够明显改善患者的生存质量。但是γδT细胞对肿瘤的杀伤不具有靶向性，如果能够提高γδT细胞对肿瘤细胞的靶向性杀伤，则必将进一步提高γδT细胞的临床应用价值。已有研究提出将CAR-T技术应用到γδT细胞上，能够提高γδT细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。但是由于γδT细胞在外周血中比例较低，因此从外周血中获得足量的γδT细胞，并用于CAR-γδT细胞的制备不仅操作复杂、成本高，而且需要抽取患者大量的外周血，给患者带来痛苦。虽然目前人们可以通过体外诱导扩增技术获得大量的γδT细胞，但是我们发现在γδT细胞扩增初期，如果按照CAR-T细胞的制备方案加入病毒，不仅不能获得CAR-γδT细胞，而且连γδT细胞都难于获得。这表明CAR-T细胞的制备方案并不适用于制备CAR-γδT细胞。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中γδT细胞对某些肿瘤细胞的靶向性杀伤作用弱的问题，提供一种简单、快速、低成本制备嵌合抗原受体γδT细胞(CAR-γδT)的制备方法，以提高γδT细胞的特异性抗肿瘤作用。

技术方案

一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离，得到外周血单个核细胞(PBMCs)；

(2)向无血清培养基加入5-10v％的自体血浆，然后加入唑来膦酸、IL-2和IL-15，得到γδT细胞刺激培养基，使用γδT细胞刺激培养基悬起PBMCs，并调整密度至2-4×10⁶个细胞/mL，接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

(3)待步骤(2)中培养至第3d时，离心去除刺激培养基，使用γδT细胞扩增培养基将细胞密度调整到2-4×10⁶个细胞/mL，以后每2-3d根据细胞密度补充扩增培养基，使细胞密度维持在2-4×10⁶个细胞/mL，每天检测γδT细胞纯度，当γδT细胞纯度大于80％时，即可收获γδT细胞；

所述γδT细胞扩增培养基的制备方法：向无血清培养基中加入IL-2和IL-15，混匀即得；