[发明专利]制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用

说明书

本发明公开一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用，包括以下步骤：使用胰酶消化对数生长期的JEG‑3人绒毛膜细胞；终止消化，利用无血清悬浮培养法富集细胞悬液中的人绒毛膜干细胞，获得JEG‑3悬浮细胞球悬液；利用胰酶和EDTA进行消化，终止消化后，加入干细胞培养基传代培养，培养过程中提供照射剂量率为165.44cGy/min的2～4Gy剂量钴⁶⁰γ射线照射，并加入基质细胞衍生因子‑1α，获得人绒毛膜干细胞培养物；离心，过滤，除去人绒毛膜干细胞，得到滤液即为人绒毛膜干细胞培养液。本法有效富集人绒毛膜干细胞，并通过改善传代培养条件，得到含有多种高含量旁分泌组分的人绒毛膜干细胞培养液，其可作为活性物质，添加到护肤美容品中，使得护肤美容品具有抗老化等功效。

技术领域

本发明涉及干细胞技术应用，具体地，涉及制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用。

背景技术

20世纪70年代，研究发现一种来源于中胚层、具有成纤维细胞样的贴壁细胞，即间充质干细胞，由于间充质干细胞具备很强的自我增殖能力和多分化潜能，已迅速成为国内外的研究热点，目前国外已有多项间充质干细胞相关应用制剂应用于临床的研究，且更多的临床试验正在进行或申请。目前已经从骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、绒毛膜、蜕膜、脐带、脐血、羊水、睾丸、扁桃体等组织中分离提取出间充质干细胞。

间充质干细胞促进组织再生的机制包括分化和旁分泌两方面的作用。分化机制认为，间充质干细胞迁移到损伤部位，分化为与受区细胞相似表型的细胞，通过移植替代修复受损组织；旁分泌机制认为，间充质干细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子影响受区多种细胞的存活、增殖、迁移和基因表达，而且作用效果有组织特异性。目前的研究认为，由于间充质干细胞移植后成活率较低，间充质干细胞通过分化发挥替代修复的作用有限。数天甚至数小时内短暂而明显的抗炎和促进增殖作用，很难用间充质干细胞的分化修复来解释。此外，无细胞条件培养基具有改善受损组织功能的作用，同样也支持间充质干细胞的旁分泌机制。大量研究表明，相比组织构建，间充质干细胞通过复杂的旁分泌功能促进组织再生的作用可能更为关键。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每10⁵-10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。有研究表明，起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分，胎盘来源的间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞具有相同的生物学特性。而且，胎盘作为分娩后的废弃物，不存在侵入性的获取过程，且与传统骨髓间充质干细胞相比，具有更强的增殖能力。人胎盘绒毛膜中含有丰富的干细胞，可作为一个崭新而丰富的来源，为实验研究和临床提供干细胞。

胎盘是胎儿发育的营养来源，最近的报告揭示了胎盘细胞上清液中存在丰富的活性因子，如碱性纤维母细胞生长因子(b-FGF)、表皮生长因子(EGF)、和转化生长因子-β(TGF-β)等，这些细胞因子具有促进创伤愈合及组织再生的特性，这为皮肤抗老化的预防治疗提供了新的方法。培养人绒毛膜干细胞(CDSC)，得到的人绒毛膜干细胞培养液(CDSC-CNM)中含有b-FGF、EGF、TGF-β、IL-6及IL-8等多种活性成分。将CDSC-CNM作用于光老化表皮细胞，有望可以使光老化表皮细胞得到修复再生。

目前，脂肪和骨髓来源的干细胞分泌因子己被用来治疗皮肤皱纹，而来源于人类胎盘的干细胞对于光老化的修复潜力尚缺乏研宄。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用，以解决上述技术问题中的至少一个。