[发明专利]靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列及其应用

说明书

本发明提供一种靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列，其核苷酸序列是：5’‑TTGGGCATGTGTATATATAAA‑3’。本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA的cDNA序列GC含量为28.6％。构建靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA慢病毒载体，进行慢病毒包装后感染人巨细胞病毒潜伏感染的细胞模型，能有效降低lncRNA4.9的核酸水平，可应用于体内外人巨细胞病毒lncRNA4.9及其调控蛋白的功能研究。

技术领域

本发明属生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列的设计、筛选以及在体内外研究lncRNA4.9及其调控蛋白功能中的应用。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒科β属的双链DNA病毒，其感染在人群中极为普遍，成年人血清抗体阳性率高达90％以上。原发性HCMV感染大多呈无症状的隐性感染，病毒可长期潜伏在体内，甚至终生带毒，但在免疫功能缺陷人群中潜伏的HCMV可被激活而引起严重疾病。HCMV还可通过胎盘、产道、母乳等途径在母婴间传播，是目前公认的引起先天性感染最常见的病原体，先天性感染的发生率约占活产儿的0.2％-2.2％。先天性HCMV感染不仅会造成流产、死胎、胎儿畸形、宫内发育迟缓等严重后果，在无症状感染患儿中导致的迟发性后遗症也不容忽视。据报道，约5％至17％的无症状先天性HCMV感染患儿在出生后表现出不同程度的神经系统后遗症，包括感觉神经性耳聋、智力发育延迟、运动障碍、癫痫、视网膜脉络膜炎等。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度＞200nt且不表现任何蛋白质编码潜能的非编码RNA。越来越多的研究表明，lncRNA参与了细胞生理、病理的各个过程。目前已知lncRNA的作用方式有两种：①转录水平的调控，如lncRNA可以识别、结合到靶基因的基因组功能区(启动子区、增强子区等)，并招募某些功能蛋白来调控靶基因的表达；②转录后水平的调控，即lncRNA也可与转录产物通过碱基互补配对结合，从而影响靶基因转录产物的剪切、拼接及翻译。

目前已知参与HCMV感染过程的病毒lncRNA主要包括lncRNA1.2、lncRNA2.7、lncRNA4.9和lncRNA5.0，部分lncRNA的调控作用已获得证实，如lncRNA2.7可通过与线粒体酶复合物结合而抑制细胞凋亡，lncRNA5.0与HCMV的毒力有密切关系。lncRNA4.9直到最近才从HCMV表达谱中被确认，其转录本长度为4922bp。研究发现，HCMV增殖感染72小时后才能检测到lncRNA4.9，且lncRNA4.9在HCMV增殖感染过程中维持低水平；而在HCMV潜伏感染的细胞中则可检测到高水平的lncRNA4.9，抑制lncRNA4.9后潜伏感染的HCMV会被激活。免疫共沉淀研究进一步揭示，lncRNA4.9可与多聚抑制复合物作用，并识别和结合在HCMV即刻早期基因IE2的启动子区，抑制IE2的转录，推测lncRNA4.9可能通过调控IE2的表达水平参与HCMV的潜伏感染。但迄今为止lncRNA4.9的确切作用机制，及其调控靶蛋白的种类和功能仍有待进一步研究。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是序列特异的双链RNA使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。RNAi的作用主要由长约21～23nt的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导，由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用靶点。RNAi靶点的选择原则主要包括：①从靶基因起始密码子下游50～100nt开始查找；②选择GC含量在25％-65％左右的mRNA区域；③避免连续的单一碱基和反向重复序列；④保证靶序列与其他基因没有同源性。制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNaseⅢ降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。目前，RNAi已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要进展。

发明内容