[发明专利]用于检测乳酸菌BCAT酶活的复合电极及其制备方法与应用、检测NADH方法

说明书

本发明属于电化学检测领域，公开了一种用于检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的复合电极，在玻碳电极表面上修饰一层MWCNT/PDDA复合膜而制得的MWCNT/PDDA‑GCE复合电极。本发明又公开了上述复合电极的制备方法。本发明还公开了用于BCAT酶活电化学检测的复合电极在检测BCAT酶活上的应用。本发明又公开了一种检测NADH的电化学方法。本发明的电化学传感器简便易行、易微型化、智能化、易于集成、操作简易等优点，最重要的是灵敏度高和选择性好，真正实现了对BCAT酶活快捷、简便以及高效的检测。

技术领域

本发明属于电化学检测领域，涉及一种新型检测乳酸菌支链氨基酸转氨酶(BCAT)酶活的方法，具体涉及一种检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的构建。

背景技术

支链氨基酸(Branched-chain amino acids，BCAAs)是指含有短脂肪族侧链的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。这三种氨基酸最先发现和研究最为广泛的是亮氨酸，但是三种支链氨基酸的代谢机理相似。支链氨基酸转氨酶(Branched-chain aminotransferase，BCAT)广泛存在于部分细菌、酵母、植物、哺乳动物和人体内且不同菌种体内BCAT活力会有很大不同。支链氨基酸在微生物的作用下可进行分解代谢，例如乳酸菌及葡萄球菌等。Stahnke通过研究发现，亮氨酸通过分解代谢可以产生3-甲基丁醛、3-甲基丁醇和3-甲基丁酸；。Beck通过对木糖葡萄球菌降解亮氨酸的研究发现这种降解还能够促进木糖葡萄球菌合成细胞膜所需的支链脂肪酸。

Afzal等研究表明，乳酸菌中亮氨酸的代谢只存在转氨反应这一条路径，在此条件基础上，通过图2乳酸菌中亮氨酸代谢机理可以判断出：在亮氨酸的代谢过程中，转氨反应伴随着还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的产生。在转氨反应的过程中，生成α-酮异己酸生成α-羟基异己酸以及异戊酰辅酶A，3-甲基丁醛生成3-甲基丁醇以及3-甲基丁酸的过程中都能够产生NADH，将亮氨酸的后续反应看做一个整体反应，则可以通过检测NADH的含量来代表转氨酶的活性，由此可以得出电化学检测NADH能够代表乳酸菌中支链氨基酸转氨酶酶活，从而达到检测转氨酶活力的目的。

现如今转氨酶检测方法的主流还是由国际临床化学和试验室医学联盟推荐的光学方法，其原理是通过包括吸光度值、光谱检测、色谱测量等检测酶促反应的终产物，终产物的含量与酶活呈正相关，酶活越高酶促反应所产生的终产物就越多，以此来建立光学检测与酶活检测的联系。除检测吸光度值来测定转氨酶活性外，国内外还有光谱测量、化学发光以及色谱分析等方法，但是由于光学方法已经有了长足的发展，在技术层面上也比其他方法更加成熟，所以其应用也更加广泛，但光学方法也有所需试剂多、成本昂贵、检测精度低等缺点。

新兴的电化学方法检测转氨酶技术目前有一定的研究，电化学检测转氨酶的原理是检测转氨酶反应中所产生的具有电活性的物质，通过捕捉电极表面上电化学活性物质氧化还原反应产生的电信号联系转氨酶反应与酶活性。现如今电化学检测转氨酶的方法主要是检测产生的电活性物质H₂O₂，也有学者通过电化学微分脉冲法检测NAD⁺来反应酶活，但是由于H₂O₂物不稳定，NAD⁺来的电化学响应不灵敏，而NADH作为一种稳定的电活性物质在电化学领域有着广泛的应用，其作用原理为NADH在电极表面被氧化生成NAD⁺同时释放电子产生电流，产生的电流则通过电化学传感器被检测。

NADH的电化学检测方法现如今已经多种多样，由于NADH在裸电极基体上的不可逆氧化，其在相当大的电位下会伴随着电极表面的钝化。因此，研制一种灵敏度高，选择性好，操作简易的检测方法是本发明的目的所在。