[发明专利]CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法

说明书

本发明提供一种CHO‑K1悬浮驯化培养基及驯化方法，所述培养基至少包括：CD CHO Medium、IGF‑1、泊洛沙姆188、条件培养基（Condition Medium）。采用上述培养基驯化CHO‑K1细胞使得细胞培养时间短（小于2个月），扩增速度快，细胞不结团且活率高。

技术领域

本发明涉及一种CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

CHO，是1957年美国科罗拉多大学Dr.Theodore T.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是生物工程上广泛使用的细胞。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。可形成有活性的二聚体(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO)，CHO为表达复杂生物大分子的理想宿主。

工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。该细胞可从各大保藏中心采购或者各个实验室保存的细胞获得。

该细胞系通常是在10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)中培养。细胞在贴壁培养时，生长数量依赖于培养面积，即使在融合率90％以上，单位面积的细胞密度很难超过10⁵cells/m，而且传统的贴壁培养模式中，需要在培养基中添加10％的优质胎牛血清，一方面增加了培养成本，另一方面由于血清中很容易携带外源病毒、补体等物质而导致细胞的培养效果不稳定或者引入安全风险。所以，在现在生物医药开发中，通常将贴壁血清培养的CHO-K1细胞悬浮驯化至无血清悬浮高密度生长。但由于目前没有效果突出的驯化培养基及驯化方法，导致贴壁悬浮驯化过程漫长(5-10个月)且存在较大的失败概率，即使驯化成功，也容易出现细胞易结团、活率低、倍增时间长等缺点。

因此，提供一种性能优异的培养基及培养方法十分必要。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法，用于解决现有技术中CHO-K1培养时间长、易结团、活率低、以及倍增时间长的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种CHO-K1悬浮驯化无血清培养基，所述培养基至少包括以下重量份的组分：

CD CHO Medium：为一款商业化无血清培养基，且化学成分限定(Chemicallydefined)，是目前市场上最常用地CHO-K1细胞悬浮培养基。

IGF-1：为大肠杆菌表达的重组蛋白，为胰岛素的替代物，价格较胰岛素便宜数十倍，且不是动物源成分，无外源病毒引入的风险。

泊洛沙姆188：Poloxamer188，聚氧乙烯聚氧丙烯，为常用药用辅料，被用作乳化剂或者增溶剂。其低浓度下溶液可以有效地减少细胞接团现象。

所述血清为FBS。

条件培养基：Condition Medium(CM)，条件培养基。细胞培养3-4天后，通过离心或者过滤去除细胞后的上清，此上清中含有细胞生长过程中分泌的一些因子，对细胞的生长和分裂有促进作用。所述条件培养基为CHO-K1细胞的条件培养基，制备条件培养基的初始培养基可以为F-12K培养基或者其他适于培养CHO-K1的培养基。

本发明的另外一个方面提供了一种CHO-K1悬浮驯化培养基，所述CHO-K1悬浮驯化培养基为采用上述无血清培养基添加不超过无血清培养基总重量10％的血清获得。