[发明专利]一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种NT‑BNP单克隆抗体的制备方法，包括小鼠多次免疫、脾细胞的制备、骨髓瘤细胞的制备、饲养细胞的制备、骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合、杂交瘤细胞的筛选、NT‑BNP细胞株的克隆、大规模制取NT‑BNP单抗等步骤；本发明制备的NT‑BNP单克隆抗体特异性高、灵敏度高，主要用于制备检测NT‑BNP的试剂盒，进而可以检测出NT‑BNP在人体血浆内的浓度，帮助医生进行心脏疾病的诊断，增强了检验的特异性，增强了检验结果的准确性，提高了检测速度。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法。

背景技术

心力衰竭是指由于心脏的收缩功能和或舒张功能发生障碍不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。N端脑钠肽前体(NT-BNP)是脑钠肽前体原的蛋白酶裂解产物。脑钠肽前体原在转化酶依赖反应中形成两个多肽，BNP和N端脑钠肽前体。这两种多肽浓度在不同的心脏病患者中都有升高。心衰患者血液中这两种多肽的浓度与疾病的严重程度成正比，而心衰患者血浆NT-BNP浓度可达到几十个ng/mL，是检测心脏病患者的一项重要指标。

近年来针对NT-BNP的检测试剂盒得到了广泛的应用，多数基于抗原抗体反应，再配合相关显色试剂，因此检测较快且结果判别容易。现有技术中NT-BNP检测试剂盒的质量很大程度上由抗体性能所决定，一种敏感性强、结合速度快的抗体将有助于提升试剂盒的准确性和检测速度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法，制备的NT-BNP单克隆抗体具有效价高，特异性强的特点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)免疫：初次免疫将弗氏完全佐剂皮下多点接种BALB/c小鼠,初次免疫21天后再同样注射一次，初次免疫30天后小鼠尾静脉注射NT-BNP蛋白；

(2)脾细胞的制备：取已经免疫的BALB/c小鼠，眼球采血，分离血清，将分离后的血清作为阳性血清，通过颈脱位处死小鼠，将小鼠消毒，在无菌的条件下，取出小鼠脾脏，取出脾细胞，放入含有10ml不完全培养基的平皿，用吸管吹打数次，制成脾细胞悬液，离心机离心，不完全培养基洗涤2次，将脾细胞重悬于10ml不完全培养基中，以不完全培养基调整脾细胞浓度为1×10⁷个/mL；

(3)骨髓瘤细胞的制备：融合前10天复苏骨髓瘤细胞，放入37℃水中融化，融化后离心机离心，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5％CO₂培养箱中培养,融合当天取对数生长期的骨髓瘤细胞，收集于50ml离心管中，用不完全培养基离心洗涤2次，将骨髓瘤细胞重新悬浮于不完全培养基中，用不完全培养基将骨髓瘤细胞稀释为1×10⁶个/mL，培养箱中培养备用；

(4)饲养细胞的制备：细胞融合前2天，通过颈脱位处死未免疫的KM雌性小鼠，酒精消毒，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用HAT培养基将饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*10⁵个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO₂培养箱中培养备用；