[发明专利]建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒

说明书

一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，属于基因重组及蛋白制备技术领域。本发明的目的是用SF9细胞表达Flag‑MxA，纯化出MxA蛋白，作为校准品。制备时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试纸卡，用时间分辨荧光免疫法分析仪测定试纸卡荧光强度，进一步获得样品中MxA浓度的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒。本发明包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MxA抗体‑荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3‑5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。本发明采用昆虫细胞系统表达MxA，昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，能大量生产。

技术领域

本发明属于基因重组及蛋白制备技术领域。

背景技术

感染性疾病是指由致病微生物（细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、真菌等）通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病，其中最常见是细菌和病毒感染，需要快速诊断细菌或病毒感染，指导临床治疗方向。临床上常用检测血清中降钙素原（ Procalcitonin ,PCT）指标，来快速诊断细菌感染发生，指导抗细菌感染治疗。目前，还没有一个血液学指标能诊断病毒感染发生，需要寻找判定病毒感染血液指标，而血液中单核细胞产生粘病毒抗性基因蛋白A(Myxovirus resistance protein A，MxA）有潜力作为病毒感染指标,用于早期诊断病毒感染发生。

MxA是血液单核细胞质中蛋白，MxA基因位于21 号染色体长臂远端(21q22), 经IFN-α/β处理细胞，诱导产生78KDa MxA蛋白，MxA属于大GTP酶的动态蛋白(dynamin)超家族成员，MxA的特征是相对高分子量,自我聚合倾向,相对比较低GTP亲和力和高GTP水解速率，不同种群MxA蛋白间的同源性很高。

MxA蛋白主要由3个区域组成:(1)N端GTPase结构域,由约300个氨基酸组成,是GTP酶活性区,包含3个 GTP结合基序，1个自我组装区;(2)中央相互作用结构域:约含有150个氨基酸; (3)C端GTPase效应结构域,约含有100个氨基酸,其中含2个亮氨酸拉链结构, 形成分子双螺旋结构。

发明内容

本发明的目的是用SF9细胞表达Flag-MxA，纯化出MxA蛋白，作为校准品。制备时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试纸卡，用时间分辨荧光免疫法分析仪测定试纸卡荧光强度，进一步获得样品中MxA浓度的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒。

本发明包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MxA抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

本发明硝酸纤维素膜上包被有MxA抗体形成检测线和抗IgG抗体形成质控线。

本发明荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm；根据权利要求1所述的荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)螯合物中一种；进一步优选为铕螯合物(Europium Chelate)，激发波长是420nm，发射波长是615nm。

本发明低渗溶液是Tris,磷酸盐，碳酸盐缓冲液，盐浓度低于10mm,含0.1-0.5%NP-40, 用于裂解细胞，释放出细胞内的蛋白。

本发明所用时间分辨荧光免疫层析（TRFIA）分析仪，波长350-430nm激发光作用后，延时100-400uS，再测定波长600-650nm荧光强度。