[发明专利]从体外培养的细胞中分离Pig-a基因突变细胞的方法

说明书

本发明公开了一种从体外培养的细胞中分离Pig‑a基因突变细胞的方法及其应用。所述的方法包括以下步骤：(1)将免疫荧光染料标记的抗GPI锚连蛋白抗体、抗所述免疫荧光染料的磁珠与所述的细胞混合；(2)分离磁珠标记的细胞与磁珠未标记的细胞，所述磁珠标记的细胞为Pig‑a基因突变阴性细胞，磁珠未标记的细胞为Pig‑a基因突变阳性细胞。本发明的方法对去除细胞，例如人成淋巴TK6细胞中预存的Pig‑a阳性细胞具有较高的分离效率，15分钟内可分离1000万细胞，且操作简单，成本低廉。

技术领域

本发明属于生物细胞领域，具体涉及从体外培养的细胞中分离Pig-a基因突变细胞的方法。

背景技术

Pig-a基因位于人类X染色体短臂，参与糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)连接蛋白的早期合成。在遗传毒理检测试验中，Pig-a基因突变试验可以用于评价化合物诱导基因突变的能力。Pig-a基因突变试验是采用流式细胞术(flowcytometry，FCM)检测细胞表面GPI锚连蛋白(如CD59，CD55蛋白)的表达，并通过Pig-a基因突变率的变化评价受试物诱导基因突变的能力。

目前已有的Pig-a基因突变方法主要是利用大鼠为试验模型的动物基因突变试验。而体外培养的动物细胞的Pig-a基因突变方法尚在开发建立中。体外Pig-a基因突变试验主要以体外培养的人成淋巴TK6细胞或者小鼠淋巴瘤L5178Y细胞做为试验材料，经过受试物或者溶剂对照等处理后，检测细胞表面的CD55和CD59表面抗原表达来评价Pig-a基因是否发生了基因突变。体外培养的细胞长期培养后会累积较多的预先存在的Pig-a基因自发突变细胞。基因突变是一种低频突变，其自发突变率一般在(1～75)×10^-6。即使经过诱变剂诱导，该突变率仍然较低。因此，在进行体外Pig-a检测的时候，需要使用的细胞株有较低的基础突变值，以提高试验的灵敏度。清除长期体外传代培养的TK6或者L5178Y细胞中预存的Pig-a基因突变细胞就显得尤为重要。

目前已有的技术中，去除预存的Pig-a突变细胞的方法主要是利用免疫荧光标记后采用流式细胞仪分选Pig-a非突变细胞和抗原包被平皿吸附非Pig-a突变细胞以及有限稀释克隆法三种方法进行分选。流式分选技术可以实现较多种类的分选任务，在本实验中，流式分选的缺点是分选成本昂贵；从突变率为30％的10⁷细胞中分离Pig-a突变细胞需要1小时以上，且一次分选成本约数千元，成本较高。平皿包被抗原吸附的方法分选效率低，筛选时间长，且极有可能剩余较多的突变细胞。而有限稀释克隆法费时费力，培养并形成克隆操作较复杂，其中仅克隆培养的过程即需要耗时十天以上，后续对不同克隆的鉴定也需耗时耗力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中去除预存的Pig-a突变细胞的方法成本昂贵、且效率低的缺陷，提供一种从体外培养的细胞中分离Pig-a突变细胞的方法及其应用。应用本发明的方法可以较高的分离效率去除细胞，例如人成淋巴TK6细胞中预存的Pig-a阳性细胞，15分钟内可分离1000万细胞；且操作简单，成本低廉。

免疫磁珠是一种可以超顺磁微核，经过免疫抗体偶联后可与特定抗原或者荧光素连接。本发明人创造性地将该技术应用于Pig-a突变细胞的分离。

本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：

本发明提供一种从体外培养的细胞中分离Pig-a基因突变细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将免疫荧光染料标记的抗GPI锚连蛋白抗体、抗所述免疫荧光染料的磁珠与所述的细胞混合；

(2)分离磁珠标记的细胞与磁珠未标记的细胞，所述磁珠标记的细胞为Pig-a基因突变阴性细胞，磁珠未标记的细胞为Pig-a基因突变阳性细胞。