[发明专利]一种三阴乳腺癌预后预测标志物及其检测方法

权利要求书

1.一种三阴乳腺癌预后预测标志物，其特征在于，所述三阴乳腺癌预后预测标志物为EVI-1蛋白或CRT蛋白。

2.根据权利要求1所述的三阴乳腺癌预后预测标志物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制作乳腺癌组织石蜡切片；

2)脱蜡和水化

石蜡切片先后置于二甲苯中浸泡2次、15分钟/次，无水乙醇中浸泡2次、3分钟/次；分别在95％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液中浸泡3分钟，用自来水冲淋1分钟；

3)高压加热枸橼酸钠缓冲液组织抗原修复液

加热枸橼酸钠缓冲液组织抗原修复液至沸腾；将脱蜡和水化后的切片放入置于耐高温染色架上的压力锅中，加热至喷汽，2分钟后，压力锅离开热源，自然冷却5分钟；用自来水冲洗使其冷却，待冷却至室温后取出切片；用蒸馏水冲洗2次、3分钟/次；再用PBS溶液冲洗3次、3分钟/次；

4)阻断内源性过氧化物酶

将步骤3)得到的切片除去PBS溶液，加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下培育10分钟，PBS溶液冲洗3次、3分钟/次；

5)加EVI-1蛋白，CRT蛋白一抗或空白对照试剂

将步骤4)得到的切片除去PBS溶液，分为三份，分别加100μL的EVI-1蛋白一抗，CRT蛋白一抗或空白对照试剂，室温下培育60分钟，PBS溶液冲洗3次、3分钟/次；

6)加酶标聚合物

将步骤5)得到的切片除去PBS液，对于在PBS溶液冲洗前加过100μL的EVI-1蛋白一抗和CRT蛋白一抗的切片，分别加100μL的EVI-1蛋白二抗和CRT蛋白二抗，室温下培育15分钟，PBS溶液冲洗3次、3分钟/次；

7)显色

将步骤6)得到的切片除去PBS溶液，加100-200mL DAB显色液，培育3-5分钟；

8)复染

将步骤7)得到的切片用自来水冲洗，加100-200mL苏木素体细胞染色液培育10-30秒；PBS溶液或自来水冲洗反蓝；

9)脱水、透明、封片

在85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液、无水乙醇中分别浸泡3分钟，用二甲苯进行透明处理，以中性树胶和盖玻片封片；

10)评价

对步骤9)得到的切片采用光学显微镜进行观察胞质和/或胞核的颜色，计算阳性细胞数占总细胞数的百分数；

EVI-1蛋白，CRT蛋白阳性判断标准为：EVI-1蛋白以细胞质和/或细胞核出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，CRT蛋白以细胞核和/或细胞质出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性；每张切片随机选取5个高倍视野观察，根据组织染色强度及阳性细胞面积进行综合评分；

综合评分具体准则如下：

(1)染色强度：

无着色为0分，弱染色为1分，中等染色为2分，强染色为3分；

(2)阳性细胞百分比：

无阳性细胞为0分；

大于或等于1％，且小于或等于25％为1分；

大于或等于26％，且小于或等于50％为2分；

大于或等于51％，且小于或等于75％为3分；

大于或等于76％为4分；

(3)EVI-1蛋白或CRT蛋白的综合评分的标准：

染色强度和阳性细胞面积百分比两项得分相乘，0分～4分为低表达组，6分～12分评估为高表达组。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤10)中，对应于不同的表达组，其三阴乳腺癌预后的情况分别为：

EVI-1蛋白，CRT蛋白为双低表达组：无进展的时间间隔在5年以上；

EVI-1蛋白为低表达，CRT蛋白为高表达组：无进展的时间间隔在3年以上；

EVI-1蛋白为高表达，CRT蛋白为低表达组：无进展的时间间隔在1年以上；

EVI-1蛋白，CRT蛋白为双高表达组：无进展的时间间隔在1年以下。