[发明专利]通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法

权利要求书

1.通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，包括以下步骤：

(1)comA基因过表达载体pCBS-LPComAR的构建

设计引物ComA-F和ComA-R，以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因657bp；

设计引物PamyJ-F和PamyJ-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；

设计引物L-amy-F和L-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp；

扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pComA-T、pPamyJ-T、pLamy-T，于-20℃条件下保存备用；

pComA-T用KpnI和NcoI双酶切后获得comA片段，与经过相同双酶切处理的pCBS载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pCBS-ComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；

pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS-ComA载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pCBS-PComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；

pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS-PComA载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，消除载体上的BamHI酶切位点，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-LPComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；

设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有BglII和NcoI酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段952bp以及pCBS-LPComA载体的部分片段30bp，与经过BglII和NcoI双酶切处理的pCBS-LPComA载体，用同源重组酶连接，构建pCBS-LPComAR载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌JM110，用于进一步的电转化；

(2)过表达comA基因枯草芽孢杆菌菌株的获得

以枯草芽孢杆菌fmbJ制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的comA基因过表达载体pCBS-LPComAR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ，在基因组淀粉酶位点发生双交换，在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长，且PCR验证出现PamyJ+comA的基因片段，此时获得的菌株即为过表达comA的菌株，命名为fmbJcomA；该菌株既包括的原本基因组上的comA基因，且在淀粉酶位点处插入了同样的comA基因，成为过表达comA基因菌株，即为所得到的提高抗菌肽bacillomycin D产量的菌株。

2.权利要求1所述方法获得的过表达comA基因枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA。

3.权利要求2所述过表达comA基因菌株fmbJcomA在生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽bacillomycin D中的应用。