[发明专利]用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA及应用

说明书

本发明提供了用于靶向敲除人OC‑2基因的特异性sgRNA及应用。本发明以人基因组上OC‑2基因为靶标，设计并通过一系列筛选、分析，获得了能够高效、特异、精准靶向人OC‑2基因的sgRNA分子，如SEQ ID NO.2～4所示。本发明还提供了含有所述的特异性sgRNA的慢病毒载体、慢病毒。同时，本发明也提供了一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除人OC‑2基因的方法，可获得稳定的OC‑2基因敲除株。本发明的特异性sgRNA可通过CRISPR/Cas系统阻断卵巢细胞中OC‑2基因的表达，显著抑制卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭能力，为卵巢癌的研究和临床治疗治疗提供了新的方向和思路，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，特别涉及用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA及应用。

背景技术

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR,Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)是在20世纪80年代后期在多种古细菌的基因组上发现的特殊序列，是大多数细菌及古细菌中不断的进化适应的一种免疫防御机制。根据参与作用的Cas蛋白基因的序列和结构特点，CRISPR-Cas系统可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三种类型，现在使用的CRISPR/Cas9系统是由最简单的II型CRISPR改造而来的，该系统由单链guide RNA(sgRNA)和一种具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成。通过Cas9蛋白形成DNA双链的断裂，而细胞通过NHEJ的修复会造成INDEL效应，进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。

II型CRISPR/Cas9技术具有强大的基因编辑效率和简单的操作，在编辑各种癌症相关基因时简便快捷。近来许多文献报道了CRISPR/Cas9系统可以破坏一些抗癌基因以加速肿瘤形成或破坏癌基因以抑制肿瘤形成。

ONECUT2(One Cut Homeobox 2,OC-2)是1999年发现的新基因，位于人类基因组第18号染色体，属于ONECUT转录因子家族。它是一种转录因子，其蛋白结构包括一个短片段和不典型结构同源域，能与相应基因的DNA序列结合而激活其表达。OC-2参与肝脏、胰腺、免疫系统、视网膜、神经系统、小肠等不同器官和组织的发育和细胞分化。

虽然CRISPR/Cas9系统是目前基因编辑工具之一，但要应用于特定靶向基因，如何选择合适的序列、并针对该序列进行精心设计并获得高效、特异、精确靶向目标基因的sgRNA是关键，而这也是目前的技术难点之一，这关系到sgRNA是否能够正确结合在目的基因上，是否会脱靶，能否引发Cas9蛋白正确、精确地行使其切割功能，将直接影响CRISPR/Cas9系统对目标基因的特异性敲除。切割成功后，蛋白确实没有表达，还是存在部分表达，是敲低还是敲除，这对实验的成功带来了比较大的困难。

目前，尚未见成功通过CRISPR/Cas9系统对ONECUT2实现精确敲除的报道。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA。所述的特异性sgRNA能够高效地靶向人OC-2基因，尤其是卵巢癌细胞OC-2基因，并可通过CRISPR/Cas系统阻断卵巢细胞中OC-2基因的表达，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。

本发明的第二目的在于提供一种CRISPR/Cas慢病毒载体。

本发明的第三目的在于提供一种慢病毒。

本发明的第四目的在于提供一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人OC-2基因的方法，构建了CRISPR/Cas-sgRNA表达系统，实现了人OC-2基因的特异性敲除。

本发明的第五目的在于提供所述的特异性sgRNA或CRISPR/Cas慢病毒载体的应用。通过对本发明得到的OC-2基因细胞敲除株进行功能分析，发现敲除OC-2基因后可以显著抑制肿瘤的生长，从而为卵巢癌的研究和临床治疗治疗提供了新的方向和思路。