[发明专利]一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株及其应用

说明书

本发明公开了一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株及其应用，把具有光激活性质的荧光蛋白基因和外泌体膜上标志性CD63蛋白基因进行融合构建成重组质粒，通过脂质体介导的质粒转染技术转染Hela细胞，通过药物筛选获得能够稳定表达光激活荧光蛋白标记的外泌体的Hela细胞。借助于光激活荧光蛋白，进行分离纯化的外泌体以及细胞内CD63蛋白分布的单分子定位的超分辨成像研究。与传统显微镜相比，单分子定位的超分辨成像提供更好的空间分辨率，实现了有活性的外泌体单分子定位显微成像，同时也实现了细胞内CD63蛋白分布的单分子定位成像研究。

技术领域

本发明属于生物标记技术领域，具体涉及一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株的制备方法及其应用。

背景技术

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外小囊泡。直径为30-150nm的脂质双分子层结构囊泡。它作为一种重要的细胞间信息传递分子及遗传物质传递载体，外泌体内含有多种蛋白质和RNA等物质，广泛分布于人体血液、尿液、唾液等体液中以及肿瘤细胞培养液中。肿瘤细胞分泌的外泌体可以促进肿瘤血管生成，也可以通过调控肿瘤微环境来影响肿瘤的生长与转移，外泌体在肿瘤的发展中发挥重要作用。现阶段外泌体相关的荧光成像已经成为研究热点，

考虑到外泌体较小的尺寸(<150nm)，传统光学显微镜存在衍射极限，目前超分辨技术可以克服光学衍射极限问题，光学超分辨成像技术主要包括受激发射损耗显微技术(STED)，结构光照明显微技术(SIM)以及单分子定位显微技术(SMLM)。单分子定位显微技术(SMLM) 是使用特定的荧光探针，用特定波长的激光来激活荧光分子，然后用另一波长的激光激发荧光分子并成像。其中，控制激光的强度，使得每一幅图像中都只有少量稀疏的荧光分子被激活，通过计算拟合来精确定位这些单分子荧光的位置信息。目前单分子定位显微技术主要包括光激活定位显微技术(PALM)和随机光学重构显微技术(STORM)。光激活定位显微技术主要是利用光激活荧光蛋白或光激活染料标记蛋白质，调节激光器的能量，用低能量的激活光照射细胞，可以激活视野下的几个荧光分子，而且一次仅激活这几个荧光分子。然后用激发光检测，通过高斯拟合来精确定位这些被激活的荧光单分子。这些分子的位置被确定之后再使用激发光长时间照射这些分子，漂白这些已经定位正确的荧光分子，这样能够保证在下一轮的激活光照射之下这些分子不能再被激活。通过反复的激活-激发-漂白的循环，持续上千次后，得到细胞内荧光分子的精确定位信息，将这些分子的定位点叠加到一张图上，最后得到了一张比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微成像图。

目前单分子定位超分辨技术用于外泌体研究中，主要是通过外泌体膜上标志性蛋白进行间接免疫荧光(IF)标记以及借助有闪烁功能的细胞膜染料。比如文献中报道外泌体膜蛋白 CD63首先用一抗标记，然后用标记有Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647的二抗偶联进行信号放大(Chen etal.ACS Appl Mater Interfaces 2016,8(39),25825-25833),Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647染料，在开关状态之间可以可逆地进行数百次循环，非常适合使用在PALM/STORM 的超分辨率成像中。这种标记技术存在一定弊端，间接免疫荧光技术进行生物样品标记需要进行样本固定处理环节，导致生物样本自身是没有活性的。而借助于生物膜染料标记后需要对生物样品进行纯化处理，避免未标记上的染料的干扰。

发明内容

为了解决上述问题，本发明公开一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒，所述重组质粒由荧光蛋白基因和外泌体膜上标志性CD63蛋白基因进行融合构建而成。

对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述的荧光蛋白选自PAmcherry、Dronpa、 mEos2或mGeos。