[发明专利]一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法

说明书

一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，它涉及林木种苗繁殖领域。本发明要解决目前红松器官发生困难，不定芽分化率低的问题。它括以下几个步骤：(1)外植体的取材与消毒处理；(2)不定芽的诱导分化培养；(3)不定芽的伸长培养；(4)再生植株的生根诱导培养。以经催芽处理的红松种子为外植体接种在分化培养基上，培养30d；获得不定芽后，将不定芽转移至伸长培养基上，继续培养60d(中间继代一次)，待丛生苗长至2‑3cm长时，将其切割分离并转接入生根培养基驯化。本发明不定芽诱导率达92.2％，每个外植体平均芽数达10‑12个，伸长生长培养60d芽高3.5cm，生根率达52％。

技术领域

本发明涉及一种林木种苗繁殖领域，一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法。

背景技术

红松(Pinus koraiensis)是裸子植物门松科松属高大乔木树种，是温带地带性顶极群落—红松阔叶林的建群树种，是优质的用材和坚果生产树种，具有重要的生态和经济价值。目前市场上对红松苗木的需求量很大，但由于红松生产周期长、种子结实率低、子代优良性状降低等问题导致红松良种种苗供不应求成为红松产业发展的瓶颈，而基于组培手段的离体快繁技术可有效的解决上述问题，开展红松离体培养不定芽诱导技术的研究，探索通过组培技术加快红松繁殖速度的有效途径，可最大限度的降低成本，提高繁殖系数，为推动红松工厂化育苗提供技术依据。此外，红松离体快繁体系的建立也是成功构建红松遗传转化体系的前提，可为进一步开展红松的转基因育种工作奠定基础。目前关于红松器官发生技术的相关报道较少，现有研究中多采用红松成熟合子胚作为外植体，通过离体培养直接诱导不定芽，或先进行愈伤组织诱导再进行不定芽的诱导，取得了一定的效果，但经愈伤组织再诱导不定芽存在容易产生变异、优良性状难以维持的问题。现有方法中采用红松的成熟合子胚直接诱导获得不定芽，但不定芽诱导率仅为30％，诱导率偏低(红松成熟胚离体培养的研究，刘玉喜，孙洪年，陆志华，齐立志，东北林业大学学报，1991年)。

发明内容

本发明的目的是为解决目前红松器官发生困难，不定芽分化率低的问题。本发明提供一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，其不定芽诱导率高、增殖系数高。该方法主要包括所述不定芽诱导培养的四个阶段：催芽种子外植体的取材与消毒处理、不定芽的诱导、不定芽的伸长生长阶段、不定芽的生根驯化阶段。

本发明的一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，具体是通过以下步骤实现的：

(1)外植体的取材与消毒处理：取前一年收获的经混沙低温窑藏催芽处理的成熟红松种子，首先将红松抽出的芽体从种壳中取出，去掉胚乳后，洗衣粉水洗涤，流水下冲洗干净，去除种壳后采用质量百分含量为10％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗5次，体积百分含量为70％酒精浸泡1mim，无菌水冲洗5次，再置于质量百分含量为0.1％的升汞溶液中消毒10min后，无菌水冲洗5次，即得到经过预处理的催芽红松种子外植体；

(2)不定芽的诱导：将步骤(1)消毒处理获得的外植体于超净工作台中切去胚根部位，按照形态学方向竖直放置于DCR培养基中进行不定芽的诱导培养；其中，DCR培养基中含1～3mg/L KT、0.2mg/L TDZ、500mg/L酸水解酪蛋白、500mg/L L-谷氨酰胺、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，DCR培养基pH值5.7～5.8；

或者DCR培养基中含1～3mg/L KT、0.5mg/L TDZ、500mg/L酸水解酪蛋白、500mg/LL-谷氨酰胺、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，DCR培养基pH值5.7～5.8；

诱导培养条件：温度23±2℃、湿度60％～70％、光照时间14h/d、光照强度：2000-3000lux，培养时间为30d；